高效液相色譜法測定止血寶顆粒中咖啡酸的含量

(楊盧軍 秦榮新 黃義昆)

(廣西柳州市人民醫院藥劑科 廣西柳州 545006)

止血寶顆粒是由小薊經提取后加輔料制成的綠褐色至深褐色顆粒劑,具有涼血止血,祛瘀消腫作用。涼血止血、祛瘀消腫。常用于鼻出血、吐血、尿血、便血、崩漏下血,外傷出血,癰腫瘡毒等癥。小薊為菊科薊屬植物刺兒菜Cirsium estosum(Willd)MB。生長于海拔140～2650米的地區,一般生于荒地、草地、山坡林中、路旁、灌叢中、田間、林緣及溪旁。有人工栽培作藥用。夏、秋二季花開時采割,除去雜質,曬干[1]。小薊為傳統的止血中藥,已證實其具有止血作用,小薊主要含有黃酮類、有機酸類以及甾醇類化合物[2]。咖啡酸具有較廣泛的抑菌作用,但在體內能被蛋白質滅活,另外還具有縮短血凝及出血時間的作用。本實驗采用50%甲醇,通過超聲波取樣后,用HPLC法測定咖啡酸含量,分離良好,精密度高。

1 儀器及試藥

1． 1 儀器

島津LC-10AT泵,島津SPD-10AVP紫外檢測器(日本津島公司);Sartorius BP211D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.2 試藥

甲醇為色譜純,水為重蒸餾水,其余試劑為分析純。

1.3 對照品

咖啡酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號：070417)。

1.4 試樣

止血寶顆粒(陜西永壽制藥有限責任公司,批號：071025、071225、080216)。

表1 加樣回收試驗結果

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱;Hypersil C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相：甲醇-0.4%磷酸(12∶88),流速為0.5mL.min-1;檢測波長為323nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取減壓干燥至恒重的咖啡酸對照品,加50%甲醇制成50.3μg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取裝量差異項下[4]的本品,研細,約取1g,進行精密稱定,然后加人10mL50%的甲醇,稱定重量,超聲處理(頻率40KHz,功率250W)30min,放冷至室溫,用50%甲醇溶液補足減失的重量,搖勻濾過,精密量取續濾液1～10mL棕色量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)濾過,避光保存,即得。同法制得止血寶顆粒陰性空白溶液。

2.4 方法

2.4.1 取對照品溶液、供試品溶液、陰性空白溶液各10μL,注入液相色譜儀,按“2.1”項下色譜條件進行測定。陰性對照色譜圖無色譜峰出現,表明其它成分對咖啡酸的測定無干擾。

2.4.2 標準曲線的制備 稱取咖啡酸對照品,加50%甲醇制含1.2024mg·mL-1咖啡酸的溶液為儲備液,分別取儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,按“2.1”項下色譜條件分別進樣10μL進行測定。結果表明進樣量與峰面積呈良好線性關系。

2.4.3 吸取10μL“2.2”項對照品溶液,連續進樣5次,記錄色潛圖,求得峰面積的RSD為0.68%,表明精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取樣品5份,按“2.3”項供試品溶液制備方法同法操作,測定咖啡酸的含量,其RSD為1.2%。

2.4.5 加樣回收實驗 取已知含量樣品,精密稱定,共6份,分別加人4.356 1mg·mL-1對照品溶液1mL,混勻后,按“2.3”項供試品溶液的制備項下,自“加人50%甲醇”操作,各進樣10μL,記錄色譜圖,計算回收率,結果見表1。

2.5 樣品的測定

取3批樣品,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下,吸取10μL供試品溶液和5.0314μg·mL-1對照品溶液進樣。計算結果為3批樣品中咖啡酸的含量分別為5.225 8,5.074 5,5.165 2(mg·g-1)。

3 討論

3.1 流動相的選擇

考察了止血寶顆粒中咖啡酸在乙腈-水、甲醇-水2種體系中的分離效果。由于乙腈-水體系中,基線不穩定,干擾較大,故選擇甲醇-水體系。在此基礎上,考察了甲醇-水的不同配比,最終選擇比例為12∶88,由于水提取物成分較復雜,加人0.4%磷酸調節pH值,可抑制咖啡酸解離,改善咖啡酸的分離度,對稱性好。

3.2 流速的確定

流速對分離度起著至關重要的影響,當流速為1mL·min-1時,分離度1.1,當流速降到0.5mL·min-1時,分離度就會＞1.5,基本可達到基線分離。

3.3 實驗研究

通過本實驗研究,建立了高效液相色譜法測定止血寶顆粒中咖啡酸的含量測定法,該方法簡便易行,具有較好的準確性,可以有效控制藥品的質量。

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學工業出版社,2005：32.

[2] 潘坷,尹永芹,孔令義.小薊化學成分的研究[J].中國現代中藥,2006,8(4)：7～9.

[3] 張來新.從小薊中提取止血藥成分咖啡酸[J].中成藥,2002,24(10)：807～808.

[4] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學工業出版社,2005：244.