南麂島海洋沉積物抑菌真菌的篩選及其代謝產物特性的初步研究

李書平, 劉輝輝, 呂鳳麟, 李勁松, 劉佳明, 趙淑江

（1. 溫州醫學院 環境與公共衛生學院, 浙江 溫州 325035; 2. 溫州醫學院 生命科學學院, 浙江 溫州 325035）

南麂島海洋沉積物抑菌真菌的篩選及其代謝產物特性的初步研究

李書平1, 劉輝輝1, 呂鳳麟1, 李勁松2, 劉佳明1, 趙淑江1

（1. 溫州醫學院 環境與公共衛生學院, 浙江 溫州 325035; 2. 溫州醫學院 生命科學學院, 浙江 溫州 325035）

以7種水產病原菌為指示菌, 采用菌餅法對分離自南麂島海域的15個沉積物樣品中的78株海洋真菌進行抑菌活性初篩, 獲得了對至少一種病原指示菌有抑菌活性的菌株19株。采用打孔擴散法對這19株真菌的發酵液進行抑菌活性復篩, 共有9個菌株的次級代謝產物對一種或者幾種病原指示菌有抑制作用, 其中菌株NJ0104的次級代謝產物對除燦爛弧菌（Vibrio splendidus）之外的6種指示菌均有抑制作用, 尤以對副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的抑制活性為最強。對菌株NJ0104次級代謝產物中抑菌活性物質的初步研究表明, 抑菌活性物質在80 ℃以下、紫外照射40 min時穩定性良好, pH穩定范圍在4.0～7.0之間, 能較好地溶解于正丁醇中。結果表明: 南麂島海域的沉積物中分布著豐富的真菌資源, 分離得到的海洋真菌NJ0104具有較高的研究價值, 值得深入研究其活性成分及抑菌機理。

南麂島; 海洋沉積物; 海洋真菌; 抑菌活性; 理化性質

海洋真菌因其能夠產生結構新穎、功能多樣的生物活性物質而備受關注, 不少研究者都對海洋真菌及其活性代謝產物做了大量的研究[1～3], 但這些研究多集中在共生真菌方面, 對海底沉積物來源的真菌研究較少。海底沉積物中含有大量的有機質, 為海洋真菌提供了良好的生境, 沉積物真菌多吸附在海泥微粒上生長[4]。近幾年, 已有研究者對海洋沉積物真菌的分離及其代謝產物進行了研究, 結果發現,海洋沉積物來源的真菌能夠產生多種生物活性代謝產物, 如溶血活性、抗菌、抗腫瘤、以及抗氧化性化合物等[5-9]。

南麂島位于我國浙江沿岸海域, 距離大陸30多海里, 海域底質以粉砂質黏土為主, 該海域為臺灣暖流和沿岸流相互交匯和交替消長的區域, 成為海洋生物生長棲息的良好場所, 具有豐富的海洋生物多樣性, 被譽為“貝藻王國”, 南麂島海洋自然保護區是我國建立的第一個海島海域生態系自然保護區。近年來, 雖然不同海域沉積物真菌的報道日益增多, 但對南麂島海域海洋真菌資源的研究卻鮮有報道。另外, 目前對海洋真菌抑菌活性的研究多集中于人類致病菌上, 而在防治水產養殖病原菌方面的報道甚少。弧菌屬細菌的致病特點為傳播快、傳染率高, 已成為海水魚類養殖最大的危害, 對海洋生物弧菌病的防治已經引起了廣泛關注。黃耀堅等[10]從廈門海區潮間帶分離到287株真菌, 其中有20株能夠抑制鰻弧菌的生長。馬欣悅等[11]從大連海區的海藻中獲得了 21株對費氏弧菌有拮抗作用的附生真菌。盡管并未進行深入的研究, 但這些成果足以證明海洋真菌在防治水產病原菌方面有著巨大潛力。

本實驗對采自南麂島海域的15個沉積物樣品中的真菌進行了較為系統的分離, 從中篩選出對 7種水產病原指示菌有抑制作用的海洋真菌, 并初步研究了活性菌株代謝產物中抑菌活性物質的理化性質,旨在發掘有潛在應用價值的活性菌株, 為南麂島藥用海洋真菌資源的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集自南麂島海域5個采樣站位（圖 1）, 共15個沉積物樣品。圖中M1站位在養殖區, M2、M3、M4、M5站位位于遠離養殖區的海域。

樣品采集后, 立即裝入無菌塑料袋內, 置于放有冰塊的保溫箱內暫存, 次日送回實驗室進行處理。

圖1 南麂島海域采樣站位Fig. 1 Sampling stations in the Nanji islands

1.2 病原指示菌

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、溶藻弧菌（V. alginolycis）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、創傷弧菌（V.vulnificus）、鰻弧菌（V.anguillarum）、燦爛弧菌（V.splendidus）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。

1.3 培養基及試劑

1.3.1 真菌分離培養基

察氏培養基（CA）成分: 葡萄糖30 g, 硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g, 氯化鉀0.5 g, 硫酸鎂0.5 g, 硫酸亞鐵0.01 g, 瓊脂18 g, 陳海水 1 000 mL, pH 7.2±0.2。

沙氏培養基（SDAY）成分: 蛋白胨 10 g, 葡萄糖40 g, 瓊脂 18 g, 陳海水 1000 mL, pH 7.2±0.2。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）成分: 馬鈴薯200 g, 葡萄糖 20 g, 瓊脂 18 g, 陳海水 1 000 mL,pH 7.2±0.2。

上述真菌分離培養基均采用與樣品同一采集地點的海水和底泥浸出液配制, 兩者的體積比為 9:1。配制好的培養基, 121℃高壓滅菌30 min, 待冷卻至50～60℃時, 加入抗生物青霉素和鏈霉素, 終質量濃度均為30 mg/L。

底泥浸出液的制作方法為: 稱取與樣品同一采集地點的底泥1 000 g, 加入海水1 000 mL, 煮沸30 min, 暗處放置2 d, 取上清液, 海水定容至1 000 mL備用。

1.3.2 真菌發酵培養基

改良 CA液體培養基（A）成分: 葡萄糖 15 g, 淀粉15 g, 蛋白胨5 g, 硝酸鈉2 g, 磷酸二氫鈉1 g, 氯化鉀0.5 g, 硫酸鎂0.5g, 硫酸亞鐵0.01 g, 硫酸銨1 g,陳海水1 000 mL, pH 7.2±0.2。

改良 PDA 液體培養基（B）成分: 馬鈴薯 200 g,葡萄糖15g, 陳海水1000 mL, pH 7.2±0.2。

1.3.3 指示菌培養基

營養瓊脂培養基成分: 蛋白胨10 g, 牛肉膏3 g,氯化鈉 5 g, 瓊脂 18 g, 陳海水 1 000 mL, pH 為7.2±0.2。不加瓊脂即為營養瓊脂液體培養基。

1.3.4 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）

0.2 mol/L NaH2PO4: 31.2 g NaH2PO4·2H2O 溶于1 000 mL蒸餾水中, 為A液; 0.2 mol/L Na2HPO4:71.7 g Na2HPO4·12H2O溶于1000 mL蒸餾水中, 為B液; A液和B液的體積比為39 : 61。

1.4 菌株分離

將采回的沉積物樣品放在無菌操作臺上, 用滅菌刀片刮去與外界接觸的表面部分, 將1.0 g沉積物樣品放入盛有 10 mL無菌海水的三角燒瓶內, 加入分散劑聚山梨酯?80（濃度 1/20 000）[12], 于漩渦混合振蕩器上振蕩 3～5 min, 使其充分混勻, 靜置, 取上清液作為原液, 然后用無菌海水依次稀釋成 10?1、10?2、10?3三個濃度梯度。

采用常規的平板涂布法。用移液槍分別吸取10?2、10?3稀釋度的 100 μL 樣品液到相應的真菌分離培養基平板上, 用無菌涂布器在平板上涂布均勻,于28℃恒溫培養箱中培養5～7 d。待菌絲長出后, 挑取形態各異的單菌落純化, 保存在SDAY斜面上。

1.5 活性菌株的篩選

1.5.1 指示菌菌液的制備

從已活化好的營養瓊脂斜面培養基上挑取一環指示菌, 接入到營養瓊脂液體培養基中, 28℃培養24 h, 即得指示菌菌液。采用平板菌落計數法測定指示菌液所含活菌數, 并將其稀釋成密度為1×105CFU/mL的菌液, 備用。

1.5.2 活性菌株的初篩

采用菌餅法[13]。用直徑 8 mm的打孔器分別在生長 7 d的海洋真菌菌落邊緣和空白真菌培養基上制備菌餅, 然后將菌餅分別置于涂有病原指示菌的營養瓊脂固體培養基上, 以空白真菌培養基的菌餅作對照, 于28℃培養24 h, 觀察抑菌圈的有無, 以初步篩選抑菌活性菌株。

1.5.3 海洋真菌發酵液的獲得

挑取初篩具有抑菌活性的菌株, 用 SDAY斜面培養基活化后, 分別接種至200 mL改良CA、PDA真菌發酵培養基中, 于28℃、140 r/min的搖床上振蕩培養10 d后取出, 5 000 r/min離心10 min, 除去菌絲體即得發酵液, 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.5.4 活性菌株的復篩

采用打孔擴散法[14]。用移液槍吸取指示菌菌液（1×105CFU/mL）100 μL, 涂布于營養瓊脂固體培養基上, 用直徑8 mm的打孔器在培養基上打孔, 向孔中注入200 μL過濾后的海洋真菌發酵液, 28℃培養24 h, 游標卡尺測量抑菌圈大小, 以空白發酵培養液為對照。

1.6 菌株 NJ0104抑菌活性物質部分理化性質

為了分離純化 NJ0104菌株次級代謝產物中的抑菌活性物質, 有必要對其理化性質進行初步研究。取NJ0104菌株的改良PDA發酵培養液適量, 5 000 r/min離心10 min后, 分別收集上清液和菌絲體, 備用。

1.6.1 抑菌活性物質萃取實驗

取10 mL上清液5份, 分別加入10 mL極性大小不同的正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、環己烷和石油醚, 置磁力攪拌器上緩慢攪拌均勻后靜置過夜, 分別收集有機相、水相。用氮吹儀分別將有機相、水相濃縮（除去有機溶劑）后, 無菌水定容至原上清液的體積, 測定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未加任何有機溶劑的原上清液為對照。

菌絲體用 30 mL丙酮提取過夜, 離心后取上清液, 用氮吹儀濃縮（除去丙酮）后, 無菌水調整至原上清液的體積, 測定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未加任何有機溶劑的原上清液為對照。

1.6.2 熱穩定性試驗

取10 mL上清液18份, 隨機分為6組, 每組設3個重復, 其中5組分別在40、60、80、100℃的水浴中加熱30 min及121℃高壓處理30 min, 冷卻后測定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未經加熱的原上清液為對照組。

1.6.3 紫外穩定性試驗

取10 mL上清液21份, 隨機分為7組, 每組設3個重復, 其中6組分別置于直徑為9 cm的培養皿中, 在20 W紫外燈下約60 cm處分別照射10、20、30、40、50、60 min后測定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未經紫外照射處理的原上清液為對照組。

1.6.4 pH穩定性試驗

取10 mL上清液39份, 隨機分為13組, 每組設3個重復, 其中12組用1 mol/L的HCl或NaOH溶液分別調整pH值至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12, 4℃放置1 d后, 調回pH值至7.0, 并用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液調整每份至等體積后測定抑菌活性, 以副溶血弧菌為指示菌, 未經pH調整的原上清液為對照組。

1.7 數據分析與處理

實驗數據用統計軟件11.5進行單因素方差分析,差異顯著者再做LSD多重比較, 顯著水平為P＜0.05,數據結果以均數加減標準誤差表示, Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 海洋真菌的分離

從15個海洋沉積物樣品中共分離到真菌78株,其中從M1站位中分離到的海洋真菌數量最多, 占總數量的37.2%; M3次之, 分離比例為25.4%; M2、M4和M5共計為37.4%。分析其原因可能是養殖區餌料的殘留、生物體代謝廢物及尸體相對集中, 形成了該區豐富的腐殖質, 并隨潮汐擴散到養殖區附近區域,為海洋真菌的生存和繁殖提供了充足的營養物質。

2.2 抑菌活性菌株的篩選

采用菌餅法對分離到的海洋真菌菌株進行抑菌活性初篩, 共有19株真菌對一種或者幾種病原指示菌有抑制作用, 占分離總數的24.4%。采用A、B兩種培養基發酵培養上述具抑菌活性的菌株, 打孔擴散法進行活性測定, 結果表明: 共有9株真菌的代謝產物對至少一種病原指示菌有抑菌活性（表 1）, 其中有5株真菌可抑制至少3種指示菌; 菌株NJ0101、NJ0104同時對副溶血弧菌、創傷弧菌、鰻弧菌、惡臭假單孢菌有抑制作用, 具有較廣的抑菌譜。相同培養條件下, 同一菌株經兩種不同培養基發酵后,表現出的抑菌活性有顯著的差異, 菌株NJ0104在B培養基中產生抑菌活性次級代謝產物, 發酵液表現出較強的抑菌能力, 相同培養條件下在 A培養基中的發酵液并無抑菌活性; 菌株NJ0124在A培養基中的發酵液有抑菌活性; NJ0101、NJ0137等7個菌株在 A、B兩種培養基中均能產生抑菌活性代謝產物,但其抑菌譜及抑菌活性強弱不同。

海洋真菌NJ0104在B培養基中產生的次級代謝產物對除燦爛弧菌之外的6種指示菌均有抑制作用,尤其對副溶血弧菌具有很強的抑制活性, 抑菌圈直徑達到25.70 mm（圖 2）。

表1 海洋真菌發酵液對幾種不同指示菌的抑菌活性Tab. 1 Antibacterial activities of fungal fermentation broths against different indicator bacteria

圖2 海洋真菌NJ0104對副溶血弧菌的抑制作用Fig. 2 The inhibition ofV. parahaemolyticusby marine fungi NJ0104

2.3 菌株 NJ0104發酵液中抑菌活性物質的部分理化性質

2.3.1 抑菌活性物質萃取實驗

采用石油醚、環己烷、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯萃取抑菌活性物質, 結果如表2所示。

表2 有機相和水相的抑菌圈直徑Tab. 2 Inhibitory zone diameters of the organic phase and aqueous phase

該物質難溶于極性較小的有機溶劑如石油醚、環己烷和氯仿, 微溶于乙酸乙酯, 正丁醇能較好地萃取抑菌活性物質, 故可采用正丁醇為萃取溶劑以提取抑菌活性物質。

用丙酮對菌絲體進行提取, 提取液不顯示抑菌活性, 表明抑菌活性物質不存在于菌絲體中。

2.3.2 熱穩定性

統計分析結果顯示, 溫度對活性物質的抑菌能力有顯著影響（P＜0.01）, 與 0℃（對照組）相比, 40℃時抑菌圈直徑沒有明顯變化, 無顯著差異（P=0.214）,其他處理組的抑菌圈直徑均明顯變小, 且差異極顯著（P＜0.01）, 各處理組之間也存在極顯著差異（P＜0.01）。

活性物質的熱穩定性如圖 3所示, 當溫度為 60℃時, 抑菌圈直徑為 24.87 mm, 殘留活性仍能達到96%以上; 當溫度超過 80℃以上時對活性物質的穩定性影響較大, 抑菌效果變差, 在 121℃時徹底失去活性。表明抑菌活性物質在 80℃以下具有良好的熱穩定性。

2.3.3 紫外穩定性

統計分析結果顯示, 紫外照射對抑菌活性物質的穩定性有顯著影響（P＜0.01）。與對照組相比, 各處理組的抑菌圈直徑有明顯下降, 且差異顯著（P＜0.01）; 各處理組之間也存在顯著差異（P＜0.01）。

如圖4所示, 當照射時間為30 min時, 活性物質的抑菌能力基本穩定, 仍能達到 80%以上, 但在40 min后, 活性明顯下降, 紫外照射50 min時徹底失去活性。表明抑菌活性物質在紫外照射40 min內具有良好的穩定性。

圖3 抑菌活性物質的熱穩定性Fig. 3 Thermal stability of antibacterial substances

圖4 抑菌活性物質的紫外穩定性Fig. 4 Stability of antibacterial substances after incubation under UV light for different times

2.3.4 pH穩定性

統計分析結果表明, 在不同pH條件下, 活性物質的抑菌能力有顯著差異（P＜0.01）。與對照相比, pH值為 7.0時, 抑菌活性無顯著差異（P=0.401）; 在其他的pH 條件下, 抑菌能力明顯下降, 且差異極顯著（P＜0.01）; 各處理組之間也存在極顯著差異（P＜0.01）。

活性物質的pH穩定性如圖5所示, 抑菌活性隨

圖5 抑菌活性物質的pH穩定性Fig. 5 Stability of antibacterial substances at different pHs

著pH值的變化呈現先增大后減小的改變, pH 4.0時抑菌圈直徑為21.62 mm, 與對照組接近, pH 7.0時最強, pH 10.0時活性完全喪失。說明活性物質在 pH 4.0～7.0條件下相對穩定, 對強酸和堿比較敏感, 分離純化時應避免強酸和堿性環境。

3 討論

3.1 適當的前處理及合適的培養基可以增加微生物的種類和數量[15]。目前分離海洋真菌的培養基主要是借鑒陸地真菌的常用分離培養基。楊遠航等[12]認為, 加入底泥浸出液的培養基所培養出來的真菌數量高于不加底泥浸出液的培養基。因此本實驗采用添加有海洋真菌生境的海泥浸出液的培養基來分離真菌, 同時采用聚山梨酯?80做分散劑, 以促使海洋真菌從沉積物樣品中釋放出來。

3.2 對不同海域沉積物中海洋真菌的抑菌活性代謝產物的研究國內已有一些報道[16,7]。本實驗對分離自南麂島海域沉積物樣品中的78株真菌的抑菌活性測定結果表明, 9株真菌的次級代謝產物對一種或者幾種指示菌有抑菌活性, 尤其值得注意的是有些菌株顯示很高抑菌活性, 表明該海域的沉積物中分布著豐富的真菌資源, 是開發抗菌藥物的天然寶庫。在這些產抑菌活性次級代謝產物的海洋真菌中, 有 7.8%的菌株對鰻弧菌有抑制作用, 3.8%的菌株對副溶血弧菌有抑制作用, 這與黃耀堅和Christophersen的研究結果基本一致[10,17]。

3.3 復篩所得的抑菌活性菌株的數量遠低于初篩,造成此結果的主要原因可能有以下兩點: （1）初篩過程中, 一些菌株的抑菌現象是由于營養或空間競爭造成的假陽性結果[18]; （2）菌株在所試的發酵培養基及培養條件下不產生抑菌活性物質或產生的抑菌活性物質濃度太低在所試的條件下觀察不到抑菌現象。發酵培養基不僅會影響菌體的生長, 還會改變微生物代謝產物的產量和類型[19-20]。如在活性篩選時,同樣條件下, 菌株NJ0104采用B培養基發酵時顯示較強的抑菌活性, 但采用A培養基發酵時沒有活性。可見, 不同的發酵培養基對海洋沉積物真菌活性代謝產物的合成有較大的影響。因此在后期的篩選工作中將選擇多種培養基同時進行發酵, 以提高活性菌株的篩選得率。

3.4 抗生素藥物的長期濫用導致了病原菌耐藥性增強, 使常規抗生素在治療相關性疾病時失效、水產品藥物殘留問題日益突出, 從天然產物中尋找安全有效地防治海洋生物弧菌病的替代藥物已是迫在眉睫。本研究篩選出能夠產生抑制病原指示菌次級代謝產物的海洋真菌9株, 其中菌株NJ0104的次級代謝產物不但抑菌譜廣, 而且對副溶血弧菌的抑菌活性極其明顯, 對海洋生物弧菌病的防治具有一定的意義。菌株NJ0104的抑菌活性物質在80℃以下、紫外線照射 40 min時穩定性良好, pH穩定范圍在4.0～7.0之間, 能較好地溶解于正丁醇中, 其抑菌機理以及具體活性成分的分析仍需要進一步研究。

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Received: Feb., 23, 2010

Key words:Nanji Island; marine sediment; marine fungi; antibacterial activity; physical and Chemical properties

Abstract:From fifteen sediment samples collected from the Nanjidao sea area, 78 marine fungal strains were isolated and evaluated against seven types of pathogenic vibrio from mariculture organisms. The antibacterial screening showed that nineteen strains could inhibit at least one pathogenic vibrio, and nine of these produced antibacterial metabolites, which had activity against one or several types of pathogenic vibrio. The strain NJ0104 with wide antimicrobial spectrum had the strongest activity againstVibrioparahaemolyticus. A preliminary study of antibacterial metabolites produced by NJ0104 demonstrated that they had preferable thermal stability at 80℃,ultraviolet stability within forty minutes and pH stability at 4.0～7.0, and antibacterial substances could be well dissolved in butanol. The active ingredients and antibacterial mechanism of NJ0104 were worth further intensive study.

Isolation of antibacterial fungus from sediment of Nanji Island and properties of its metabolites

LI Shu-ping1, LIU Hui-hui1, Lü Feng-lin1, LI Jin-song2, LIU Jia-ming1,ZHAO Shu-jiang1
（1. Wenzhou Medical College, School of Environmental Science and Public Health, Wenzhou 325035, China;2. Wenzhou Medical College, School of Life Science, Wenzhou 325035, China）

X172; Q939.5

A

1000-3096（2011）02-0058-06

2010-02-23;

2010-06-14

溫州市科技計劃資助項目（Y20080092）; 浙江省科技廳面上項目（2009C33004）

李書平（1984-）, 女, 河南南陽人, 碩士, 主要研究方向: 海洋微生物活性物質的提取應用, E-mail: lishuping19841006@126.com;趙淑江, 通信作者, 電話: 0577-86699553, E-mail: zsj62@163.com