鎘和汞兩種重金屬離子對四角蛤蜊血細胞DNA損傷的初步研究

房 燕, 楊紅生

（1．中國科學院 海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2．中國科學院 研究生院,北京 100049）

鎘和汞兩種重金屬離子對四角蛤蜊血細胞DNA損傷的初步研究

房 燕1,2, 楊紅生1

（1．中國科學院 海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2．中國科學院 研究生院,北京 100049）

利用彗星電泳技術, 研究了不同脅迫濃度和脅迫時間下, Cd2+和 Hg2+對四角蛤蜊（Mactra veneriformis）血細胞DNA損傷的情況。研究結果顯示, 50、100和200 μg/L Cd2+脅迫14天不能造成四角蛤蜊血細胞DNA損傷。10、20和40 μg/L Hg2+脅迫均能明顯損傷血細胞DNA, 并且DNA損傷程度分別與Hg2+脅迫時間、脅迫濃度具有一定正相關性。200 μg/L Cd2++20 μg/L Hg2+復合脅迫組, 四角蛤蜊血細胞 DNA損傷程度隨脅迫時間延長而增加, 并且大于 Hg2+脅迫組。上述結果表明對于四角蛤蜊而言, Hg2+潛在的遺傳毒性大于Cd2+; Cd2+和Hg2+對DNA的損傷具有協同作用。

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）; Cd2+; Hg2+; DNA損傷; 彗星電泳

工農業的快速發展以及人口的急劇增加, 特別是沿海地區工業的快速發展, 導致了近海海洋環境污染日益突出。調查結果顯示, 我國近岸海域部分海水和沉積物樣品中重金屬鎘（Cd）、汞（Hg）含量超標[1]。重金屬是一類毒性較大的污染物, 可以被水生生物大量富集, 引起生物體代謝的紊亂、疾病甚至死亡, 還可以通過食物鏈的生物放大作用危害人類健康[2]。而且, 許多重金屬污染物具有潛在的遺傳毒性,能夠導致DNA損傷, 引起疾病, 并危害子代健康。

雙殼貝類是監測水域污染物的常用指示生物,同時, 污染物對貝類的毒理學研究也成為研究熱點。目前, 這些研究多集中于貽貝和牡蠣。由于缺乏附著基, 在灘涂區域, 貽貝和牡蠣的分布量非常小。隨著該區域生態與環境狀況惡化, 開發其他貝類用于灘涂污染物檢測和毒理學研究是十分必要的。四角蛤蜊（Mactra veneriformis）是一種典型的埋棲型灘涂貝類, 廣泛分布在我國、韓國和日本沿海, 是我國主要的經濟貝類之一。它能夠大量富集重金屬, 具有作為污染物指示物種的潛力[3]。但是有關四角蛤蜊的毒理學研究還較少, 尤其是污染物導致四角蛤蜊DNA損傷的研究還未見報道。本研究開展了室內模擬實驗,利用彗星電泳技術評價了 Cd2+和 Hg2+對四角蛤蜊DNA損傷的情況。為重金屬毒性評價體系的建立提供技術支持, 為闡明重金屬對生物體的毒性機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗生物的馴養和脅迫實驗

實驗用二齡四角蛤蜊[殼長（3.27 ± 0.23）cm, 殼高（2.95 ± 0.31）cm, 殼寬（2.17 ± 0.17）cm, 濕質量（12.07 ± 1.56） g], 于2009年6月購自日照養殖場。在實驗室馴養 14 d[水溫（20±2）℃, 溶解氧 7.7～8.3mg/L, pH 7.9～8.1, 鹽度 33], 將四角蛤蜊轉移至聚乙烯箱內開始正式脅迫實驗。每只箱內海水體積為50 L, 放養100只四角蛤蜊。根據課題組前期研究中得到的Cd2+、Hg2+對四角蛤蜊96h LC50[4], 結合參考文獻中常用的 Cd2+、Hg2+對雙殼貝類亞致死濃度[5,6], 設置了以下 7個脅迫組 50 μg/L Cd2+、100 μg/L Cd2+、200 μg/L Cd2+、10 μg/L Hg2+、20 μg/L Hg2+、40 μg/L Hg2+、200 μg/L Cd2++20 μg/L Hg2+, 并設對照組, 每組均設2個平行。配備1.35 g/L HgCl2和2.03 g/L CdCl2·2.5H2O母液, 加入到海水中以達到相應的Cd2+、Hg2+濃度, 對照組不加Cd2+、Hg2+。實驗進行14 d, 整個實驗過程持續充氣, 并監測水體理化參數,每天固定時間換水, 換水后補加相應濃度的重金屬溶液。投餌在換水前2 h進行。

1.2 血淋巴的采集

在脅迫的第0、1、4、7、11、14天, 用1mL注射器從四角蛤蜊的閉殼肌中抽取血淋巴, 及時存放于4℃冰箱。第11天Cd2+、Hg2+復合脅迫組和第14天 200 μg/L Cd2+脅迫組, 四角蛤蜊已全部死亡, 無血淋巴可取。每組隨機取9只四角蛤蜊, 每3只混合為一個樣本。用臺盼藍染色法檢測血細胞存活率。存活率大于 95%的樣本才可以用于后續的彗星電泳實驗。

1.3 彗星電泳實驗流程

本實驗在Singh等[7]的方法上稍做改進, 具體程序如下: （1）膠板制備（烤膠法）: 在燒杯里配置100mL 0.6%正常熔點瓊脂糖, 煮沸后, 放入磨砂玻片并取出, 室溫涼干。37℃下, 取75μL低熔點膠與25μL血淋巴混勻, 用槍直接把凝膠吹到玻片上, 4℃放置 10 min。（2）裂解: 將玻片放入裂解液（2.5 mmol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L Tris-base, pH10,用前加TritonX-100和DMSO）, 4℃裂解2 h, 取出玻片, 用0.2 mol/L pH7.4的磷酸鈉緩沖液漂洗。（3）解旋: 將玻片放入水平電泳槽中, 倒入新鮮的電泳緩沖液（0.3 mol/L NaOH、1 mmol/L Na2EDTA, pH＞13）,4℃避光放置 20 min以解旋。（4）電泳: 調整電壓為25V, 調整液面高度使電流達到300 mA, 4℃避光電泳20 min。電泳結束, 用磷酸鈉緩沖液漂洗玻片。（5）中和: 用預冷的中和液（0.4 mmol/L Tris-base, pH 7.5）, 4℃漂洗3次, 每次10 min。（6）染色和觀察: 在膠板上滴加核酸染料gene finder, 染色15 min后, 在Nikon80i熒光顯微鏡 200倍下, 觀察并拍照。（7）圖像分析, 用 CASP軟件分析彗星圖像。Olive尾矩（OTM值）是彗星細胞尾長與尾部 DNA含量的乘積,與 DNA損傷有很好的正相關性[8], 作者選擇該指標用于DNA損傷的評價。

1.4 數據處理

每個玻片上隨機選擇30個細胞進行分析, 結果表示為平均值±標準差。采用 SPSS13.0軟件對數據作單因素方差分析, Turkey檢驗比較每個取樣點不同實驗組間的差異, 顯著水平為0.05。

2 結果

2.1 Cd2+脅迫對四角蛤蜊血細胞DNA的損傷

圖 1A顯示的是四角蛤蜊血細胞內未受損傷的DNA電泳后的圖片。圖 1B顯示的是細胞內損傷的DNA電泳后的圖片, 彗尾即是斷裂的DNA碎片。由圖2可見, Cd2+脅迫期間, 四角蛤蜊血細胞OTM值沒有發生顯著的變化, 表明在本實驗脅迫濃度和時間下, Cd2+未能造成四角蛤蜊血細胞DNA明顯的損傷。

2.2 Hg2+脅迫對四角蛤蜊血細胞DNA的損傷

圖1 四角蛤蜊血細胞DNA電泳Fig. 1 The comet assay ofMactra veneriformishaemocyte

由圖3可知, Hg2+脅迫第1天, 血細胞OTM值即開始顯著升高, 10 μg/L Hg2+脅迫組OTM值在第7和11天下降, 14天又上升; 20 μg/L Hg2+和40 μg/L Hg2+脅迫組第7天下降, 之后又上升。10μg/L Hg2+、20 μg/L Hg2+和 40 μg/L Hg2+脅迫組, OTM 值最高值均出現在第 14天, 分別為 9.12±0.14、13.09±2.11和15.95±3.48。OTM 值分別與 Hg2+脅迫時間、脅迫濃度具有一定的正相關性。上述結果表明 Hg2+能夠顯著誘導四角蛤蜊血細胞DNA損傷。Hg2+脅迫組與對照組OTM值的差值與脅迫時間的回歸曲線表明, 20 μg/L Hg2+和40 μg/L Hg2+脅迫組OTM值與脅迫時間具有較好的線性相關性, 相關系數分別為0.907 2和0.825; 而10 μg/L Hg2+脅迫組OTM值與脅迫時間相關性較差, 相關系數為0.564 2（圖4）。

圖2 Cd2+脅迫對四角蛤蜊血細胞DNA的損傷Fig. 2 DNA damage in haemocytes ofM. veneriformisexposed to Cd2+

圖 3 Hg2+脅迫和 Cd2++Hg2+復合脅迫對四角蛤蜊血細胞DNA的損傷Fig. 3 DNA damage in haemocytes ofM. veneriformisexposed to Hg2+and the combination of Cd2+and Hg2+

2.3 Cd2+和 Hg2+復合脅迫對四角蛤蜊血細胞DNA的損傷

由圖 3可見, Cd2+和 Hg2+復合脅迫組血細胞OTM 值在第 1天即顯著上升, 隨脅迫時間的延長,OTM 值逐漸增加。OTM 最大值出現在第 7天, 為15.17±2.94。同一時間點, 該組 OTM 值高于 Hg2+脅迫組。

圖 4 Hg2+脅迫組四角蛤蜊血細胞 OTM 值與脅迫時間的回歸曲線Fig. 4 Correlation between OTMs in haemocytes ofM.veneriformisin Hg2+-treated groups and duration of exposure

3 討論

彗星電泳是在一種在單細胞水平上檢測DNA損傷與修復的方法, 能夠評價外源污染物對細胞潛在的遺傳毒性和致癌性。由于其簡便、快速、靈敏等的特點, 被廣泛應用于遺傳毒理學、醫學、生物學和環境監測等領域。

本研究發現, 50、100和200 μg/L Cd2+脅迫14 d,不能引起四角蛤蜊血細胞DNA的損傷。這與普遍認為Cd是一種具有較微弱遺傳毒性的重金屬的觀點相一致。據報道, 200 μg/L Cd2+脅迫貽貝Mytilus edulis28 d, 100 μg/L Cd2+脅迫海鯛Sparus aurata11 d, 均不能導致血細胞 DNA的損傷[5,9]。作為生物體的防御機制, 四角蛤蜊金屬硫蛋白和超氧化物歧化酶在mRNA和蛋白水平可被 Cd2+顯著誘導[10], 有效地保護了 DNA分子免受 Cd2+毒性的傷害。但是, 大于50μmol/L 的 Cd2+能夠引起大鼠肝細胞 TRL 1215 DNA 鏈的斷裂[11]; 112 μg/L Cd2+脅迫貽貝Mytilus galloprovinciallis5 d能夠引起血細胞DNA的損傷[12]。可見, Cd2+引起的DNA損傷程度因物種、細胞類型、作用劑量和作用時間的不同而不盡相同。本研究中,200 μg/L Cd2+脅迫組, 在第14天, 四角蛤蜊已全部死亡, 表明 Cd2+可能通過其他的途徑, 而不是直接作用于DNA, 對四角蛤蜊產生較高的毒性。

本研究表明 Hg2+能夠明顯導致四角蛤蜊血細胞DNA的損傷。20 μg/L Hg2+脅迫貽貝M. edulis3 d, 32 μg/L Hg2+脅迫紫貽貝M. galloprovinciallis5 d, 血細胞DNA損傷的程度顯著增大[12-13], 與本研究結果一致。據報道, 只有當污染物在生物體內靶組織中的濃度到達一定閾值時, 才可啟動DNA修復系統[14]。結合實驗過程中, Hg2+脅迫組血細胞OTM值在第7天下降的現象, 表明生物體可能啟動了DNA修復機制,對斷裂的DNA進行一定的修復。11天 20 μg/L Hg2+和 40 μg/L Hg2+脅迫組與 14 天 10 μg/L Hg2+脅迫組,OTM 值再次上升, 表明四角蛤蜊的 DNA修復系統被持續的 Hg2+脅迫所抑制, DNA損傷程度加劇。OTM 值與脅迫時間線性相關性分析表明, 10 μg/L Hg2+組的相關性較差, 僅為0.564 2, 而20 μg/L Hg2+組和 40 μg/L Hg2+組的相關性均高于 0.8, 可見 10 μg/L Hg2+脅迫組, DNA 修復能力大于 20 μg/L Hg2+和40 μg/L Hg2+脅迫組。低濃度脅迫組DNA修復能力大于高濃度脅迫組這一現象, 也在其他的研究中得到證實[14]。隨著水體中 Hg2+質量濃度的升高, 生物體自身修復的相對作用變小, DNA損傷程度加劇,對生物體造成不可逆的損傷。

Cd2+和 Hg2+復合脅迫能夠顯著損傷四角蛤蜊血細胞DNA, 隨著脅迫時間的延長, DNA損傷程度逐漸增大。在同一時間點, 該組血細胞DNA損傷程度大于Hg2+脅迫組, 表明Cd2+的存在加重了DNA的損傷, Cd2+和Hg2+對DNA損傷具有協同作用。Cd2+能夠加重H2O2對貽貝M.edulis鰓細胞DNA的損傷[5]。Cd2+脅迫能夠通過減緩蝦Paleomonetes pugio胚胎DNA修復的過程, 加重 UV輻射和苯并芘導致的DNA損傷[15]。研究發現, Cd2+可以通過取代DNA修復過程中某些關鍵酶例如8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶鋅指結構中的 Zn2+, 導致酶活性的喪失, 干擾 DNA修復, 間接引起DNA損傷[16]。綜合本文的實驗結果,推測Cd2+可能會干擾四角蛤蜊DNA損傷的修復過程,使得DNA損傷不能及時修復, 從而加重Hg2+脅迫導致的DNA損傷。但具體的作用機制, 還需要進一步的實驗來闡明。

綜上所述, 彗星電泳技術可以成功地檢測四角蛤蜊DNA損傷, 能夠應用于重金屬對四角蛤蜊的毒理學研究領域。200 μg/L Cd2+不能造成四角蛤蜊血細胞 DNA 損傷, 10 μg/L Hg2+即可顯著誘導血細胞DNA損傷, 因此, 對于四角蛤蜊而言, Hg2+潛在的遺傳毒性大于Cd2+。Cd2+和Hg2+復合脅迫造成的DNA損傷顯著大于 Cd2+、Hg2+單獨脅迫, Cd2+和 Hg2+對DNA損傷具有協同作用。因此, 應充分重視我國近海復合污染對貝類的毒性效應, 開展更深入的研究,闡明復合污染對貝類的作用機制。

[1] Wang C Y, Wang X L. Spatial distribution of dissolved Pb, Hg, Cd, Cu and as in the Bohai sea [J]. Journal of Environmental Sciences, 2007, 19: 1 061-1 066.

[2] Booth S, Zeller D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health [J]. Environmental Health Perspectives,2005, 113: 521-526.

[3] Wang Y W, Liang L, Shi J B, et al. Study on the contamination of heavy metals and their correlations in mollusks collected from coastal sites along the Chinese Bohai Sea [J]. Environmental International, 2005, 31:1 103-1 113.

[4] 王曉宇, 王清, 楊紅生. 鎘和汞兩種重金屬離子對四角蛤蜊的急性毒性[J]. 海洋科學, 2009, 33（12）:24-29.

[5] Pruski A M, Dixon D R. Effects of cadmium on nuclear integrity and DNA repair efficiency in the gill cells ofMytilus edulisL [J]. Aquatic Toxicology, 2002, 57:127-137.

[6] Tran D, Moody A J, Fisher A S, et al. Protective effects of selenium on mercury-induced DNA damage in mussel haemocytes [J]. Aquatic Toxicology, 2007, 84:11-18.

[7] Singh N P, McCoy M T, Tice R R, et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells [J]. Experimental Cell Research, 1988, 175: 1 841-1 891.

[8] Chang M, Wang W N, Wang A L, et al. Effects of cadmium on respiratory burst, intracellular Ca2+and DNA damage in the white shrimpLitopenaeus vannamei[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, 2009, 149: 581-586.

[9] Isani G, Andreani G, Cocchioni F, et al. Cadmium accumulation and biochemical responses inSparus auratafollowing sub-lethal Cd exposure [J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009, 72:224-230.

[10] Fang Y, Yang H, Wang T, et al. Metallothionein and superoxide dismutase responses to sublethal cadmium exposure in the clamMactra veneriformis[J].Comparative Biochemistry Physiology, Part C, 2010,151: 325-333.

[11] Misra R R, Smith G T, Waalkes M P. Evaluation of the direct genotoxic potential of cadmium in four different rodent cell lines [J]. Toxicology, 1998, 126: 103-114.

[12] Bolognesi C, Landini E, Roggieri P, et al.Genotoxicity biomarkers in the assessment of heavy metal effects inmussels: Experimental studies [J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 1999, 33: 287-292.

[13] Tran D, Moody A J, Fisher A S, et al. Protective effects of selenium on mercury-induced DNA damage in mussel haemocytes [J]. Aquatic Toxicology, 2007, 84:11-18.

[14] Black M C, Ferrell J R, Horning R C, et al. DNA strand breakage in freshwater mussels （Anodonta grandis）exposed to lead in the laboratory and field [J].Environmental Toxicology and Chemistry, 1996, 15:802-806.

[15] Hook, S E, Lee R F. Interactive effects of UV,benzo[alpha] pyrene, and cadmium on DNA damage and repair in embryos of the grass shrimpPaleomonetes pugio[J]. Marine Environmental Research, 2004, 58: 735-739.

[16] Giaginis C, Gatzidou E, Theocharis S. DNA repair systems as targets of cadmium toxicity [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2006, 213: 282-290.

Received: Aug., 12, 2010

Key words:Mactra veneriformis; Cd2+; Hg2+; DNA damage; comet assay

Abstract:The objective of this study was to investigate the effects of Cd2+and Hg2+on DNA damage in haemocytes ofMactra veneriformisthat were exposed to different concentrations of Cd2+or/and Hg2+for 14 days.DNA damage was determined by the comet assay. There was no obvious DNA damage in haemocytes caused by 50,100, and 200 μg/L Cd2+during the exposure period. However, Hg2+caused significant DNA damage in haemocytes at doses of 10, 20, and 40 μg/L in a dose- and time- dependent manner. Combination of 200μg/L Cd2+and 20μg/L Hg2+induced a time-dependent increase of DNA damage. The degree of DNA damage in the combined exposure group was severer than that in Hg2+-treated groups. These results indicate that the ranking of genotoxic potential toM.veneriformisis in decreasing order: Hg2+＞Cd2+. There is a synergistic effect to DNA damage between Cd2+and Hg2+.

（本文編輯:梁德海）

Effects of Cd2+and Hg2+on DNA damage in haemocytes of Mactra veneriformis

FANG Yan1,2, YANG Hong-sheng1
（1. Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

X171.5

A

1000-3096（2011）02-0001-05

2010-08-12;

2010-10-21

國家基金委創新研究群體科學基金項目（40821004）; 國家973計劃資助項目（2007CB407305）; 國家農業部公益性計劃資助項目（nyhyzx07-047）; 國家海洋公益性行業科研專項資助項目（200805069）

房燕（1983-）, 女, 山東鄆城人, 博士研究生, 主要從事生態毒理學方面的研究, 電話: 0532-82898596, E-mail: fly12689@163.com; 楊紅生, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-82898620, E-mail: hshyang@qdio.ac.cn