產β-內酰胺酶傷寒桿菌與痢疾桿菌bla TEM耐藥基因研究

周東輝，黃麗琴，張淑華

（1．新鋼中心醫院，江西新余 338001；2.新余學院，江西新余 338004）

產β-內酰胺酶傷寒桿菌與痢疾桿菌bla TEM耐藥基因研究

周東輝1，黃麗琴2，張淑華1

（1．新鋼中心醫院，江西新余 338001；2.新余學院，江西新余 338004）

目的:研究新余市產β-內酰胺酶傷寒桿菌與痢疾桿菌bla TEM-1D型耐藥基因流行特征。方法:收集新余新鋼中心醫院、新余市人民醫院、新余市中醫院、新余市婦幼保健院2008年1月—2010年6月分離出的傷寒桿菌產酶株6株和痢疾桿菌產酶株13株共19株，用頭孢哨噻吩濾紙片法做β-內酰胺酶的定性檢測，確定為產酶株后，采用PCR技術擴增質粒bla TEM-1D耐藥基因，用Mark標記量出擴增子的大小(bp)，統計bla TEM-1D耐藥基因陽性率。結果:傷寒桿菌、痢疾桿菌產酶株bla TEM-1D耐藥基因陽性率分別為66.7%（4/6）、76.9%（10/13）。結論:bla TEM-1D型耐藥基因在本地區各家醫院間存在水平傳播和醫院內垂直傳播。

傷寒桿菌；痢疾桿菌；β-內酰胺酶；bla TEM-1D型耐藥基因1

臨床工作中β-內酰胺類抗生素的廣泛應用導致了β-內酰胺酶的產生，成為腸桿菌科細菌耐藥的主要機制。本次研究是調查新鋼中心醫院、新余市人民醫院、新余市中醫醫院、新余市婦幼保健院2008年1月—2010年6月分離出的傷寒桿菌和痢疾桿菌產酶株bla TEM-1D型耐藥基因的分布情況，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集上述4家醫院2008年1月—2010年6月分離出的傷寒桿菌和痢疾桿菌產酶株共19株（每一株至少對一種β-內酰胺類抗生素耐藥）。確定為產酶株后，采用PCR技術擴增質粒bla TEM-1D耐藥基因，用Mark標記量出擴增子的大小（bp）。

1.2 產酶株特殊耐藥表型檢測（β-內酰胺酶檢測）采用頭孢哨噻吩濾紙片法（nitrocefin test），用接種環挑取受試菌落于商品化頭孢哨噻吩濾紙片上，于10min內由黃色轉為紅色即為陽性，示該受試菌產β-內酰胺酶，即為產酶株。

1.3 bla TEM-1D耐藥基因檢測

1.3.1 PCR引物及儀器 根據GenBank收錄的質粒型TEM-1D基因序列及參考伍勇等〔1〕學者設計的引物，見表1。引物由上海生工生物工程公司合成。質粒小提取盒、PCR擴增試劑盒、2000 bpDNA Marker均為天根生化（北京）科技有限公司產品。PCR擴增儀為Perkin Elmer 9600。

表1 PCR所用的引物序列

1.3.2產酶株耐藥質粒提起 對19株產酶株按質粒小提起盒說明書提起細菌質粒。以質粒作為PCR模板。

1.3.3 PCR擴增 以上述19株產酶株的質粒作為模板進行PCR，總反應體積為25μL：質粒模板1μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Mixter液12.5 μL，用去離子水補至25μL。PCR反應循環：94℃預變性3 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸5min。

1.3.4 PCR產物分析 用1.5%的瓊脂糖（含0.5μg/mLEB），1×TAE緩沖液中電泳，2~5 V/cm，凝膠成像系統照相，以2 000 bpDNA Marker（100，250，500，750，1 000，2 000 bp）為標準，分析電泳條帶bp值。

2 結果

本組試驗菌株的bla TEM型耐藥基因經PCR擴增后的長度應為781 bp，在Mark條帶上應是750 bp附近，故統計圖1中的750 bp附近的條帶分別是：痢疾桿菌10株，傷寒桿菌4株。

圖1 bla TEM-1D型PCR產物電泳結果

3 討論

痢疾桿菌與傷寒桿菌屬于腸桿菌科細菌，而產β-內酰胺酶是腸桿菌科細菌對β-內酰胺類抗生素耐藥最重要的機制之一。細菌產生的β-內酰胺酶通過它們的活性作用位點Ser-OH對β-內酰胺環上的羧基碳發生親核攻擊使環打開，形成通過脂鍵相連的酰酶復合物中間體，然后又能迅速水解酰酶中間體的脂鍵使酶再生，并釋放β-內酰胺部分(已失活)，使細菌產生耐藥性。目前國內外有許多關于β-內酰胺酶腸桿菌科細菌耐藥性及耐藥基因型的研究報道〔2-7〕。

有學者認為細菌對β內酰胺酶抗生素耐藥主要是由質粒介導的β內酰胺酶所致,其中廣譜青霉素酶（TEM）是最常見的質粒介導的酶,能使細菌對第一、第二代頭孢菌素耐藥。在院內感染病人中產生質粒介導酶的耐藥菌，其產生耐藥性大多是在接觸抗生素后獲得的，并通過耐藥基因的轉移而播散（水平傳播），也可由基因表達而傳至下代（垂直傳播）。本次試驗顯示，本市4家醫院之間均有相同的bla TEM型耐藥基因陽性，而且同一家醫院同一個科室在不同時期有相同的bla TEM型耐藥基因陽性，提示bla TEM型耐藥基因在本地區確實存在院內感染的水平傳播和垂直傳播。本次研究通過查閱臨床相關病歷資料發現痢疾桿菌與傷寒桿菌對氨芐西林的耐藥率高達94.4%，故該藥在本地區已不宜使用。第三代喹諾酮類抗生素耐藥率低，可以首選。

PCR方法是腸桿菌科耐藥菌中檢測bla TEM的快速、有效的方法〔8〕。特別是在尚不知耐藥基因流行病學情況的條件下，應用PCR方法可以快速篩查出腸桿菌科細菌的耐藥基因型,大致了解其主要流行型別,為進一步研究提供依據。但是，本研究應用的PCR方法只是鑒定到基因型而并未鑒定到亞型，還需應用更多特異性的方法（如特異性引物的單一擴增、單鏈構象多態性PCR等技術）進行亞型鑒定。

〔1〕伍勇,徐令清,漆涌,等.大腸埃希菌質粒介導頭孢菌素酶基因型研究〔J〕.臨床檢驗雜志,2007,25（6）:407-409.

〔2〕虞春華,黃瑞．沙門菌屬耐藥機制的研究進展〔J〕.微生物學免疫學進展,2008,36（03）:38-39.

〔3〕邱雄泉,黃菊,潘曉丹,等．中山地區大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性調查〔J〕.中國醫療前沿,2008,3（14）:10-12．

〔4〕劉渠,許欣,李涌,等．沙門菌流行特點及耐藥性分析〔J〕.中外健康文摘·醫藥學刊,2008,5（2）:21-31．

〔5〕蔣火剛,李樹仁．遵義地區沙門菌、志賀菌的血清學分型及耐藥性分析〔J〕.貴州醫藥,2007,31（6）:83-84.

〔6〕楊珊明．福氏志賀菌感染161例臨床特點與耐藥性分析〔J〕.中國實用內科雜志,2006,26（11）:865-866．

〔7〕張道平,何永貴,肖學慧,等.醫院感染性標本細菌分離的變遷調查〔J〕.中華感染學雜志,2006,16（10）:1187-1188.對策的探討〔J〕.中華醫院感染學雜志,1999,9（4）:193-195.

〔8〕李虹玲,劉文恩,張運麗,等.應用多重PCR在腸桿菌科細菌中檢測blaTEM、blaSHV、blaOXA-1基因〔J〕.中國感染控制雜志,2008,7（6）:377-380.

（責任編輯 蔣 康）

Study onβ-lactamase Producing Salmonella typhi and Shigella Resistance Gene of blaTEM

ZHOU Donghui1，HUANG Liqing2，ZHANG Shuhua1
（1.Xinyu Steel Central Hospital,Xinyu,Jiangxi338001,China;2.Xinyu University,Xinyu,Jiangxi338004,China）

Objective:To study epidemiological characteristics of the β-lactamase producing Salmonella typhi in Xinyu and Shigella blaTEM-1D-type resistance gene.Methods:Isolated enzyme production strains ofSalmonellatyphi6 and Shigella 13,a total of 19 strains were collected from the Xinyu Steel Central Hospital,People's Hospital of Xinyu,Chinese Medicine Hospital of Xinyu,Maternal and Child Health Hospital of Xinyu from January 2008 to June 2010.Cephalosporins post filter papermethod was used to do thiopheneβ-lactamase qualitative detection.Affter it was defined as enzyme production strains,the lift vector plasmid was amplified by PCR blaTEM-1D resistance gene.Mark was used tomeasure the amplification the size of sub （bp length）;blaTEM-1D resistance gene-positive rate was kept.Results:Enzyme production strains ofSalmonellatyphiand Shigella blaTEM-1D resistance gene positive rates were 66.7%（4/6）,76.9%（10/13）.Conclusion:BlaTEM-1D resistance gene hasmade vertical transmission and horizontal transmission in the local hospitals.

Salmonellatyphi;shigella;β-lactamase;blaTEM-1D resistance gene

R516.3

A

1672-2345（2011）02-0022-02

2010-12-15

周東輝，主治醫師，主要從事臨床檢驗研究.