利巴韋林注射液半成品質量控制方法優化

鞏新玉 閆 晗 劉 靜 趙 璨 楊利民

（1 駐馬店市食品藥品檢驗所，河南 駐馬店 463000；2 周口市太康人民醫院，河南 周口 463000）

利巴韋林的化學名稱：1-β-D-呋喃核酸基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酰胺。

利巴韋林的結構式[1]：

分子式：C8H12N4O5

分子量：244.21

利巴韋林（Ribavirin）又稱三氮唑核苷、病毒唑、三唑核苷。為廣譜抗病毒核苷類化合物，能抑制病毒合成核酸，對多種RNA、DNA病毒有抑制作用。臨床用于病毒性感冒、腺病毒、肺炎麻疹、甲型肝炎、流行性出血熱、帶狀皰疹及病毒性腦炎等疾病的治療[2,3]。

HPLC法為中國藥典2005年版二部規定的利巴韋林（原料及注射液）含量測定的方法，專屬性強，準確可靠，重復性好，適用于利巴韋林注射液成品質量控制。因利巴韋林注射液在生產過程中，從配制到灌封不能超過12h，HPLC法消耗時間過長，流動相的配制復雜，成本較高，需要對樣品進行過濾和超聲等前處理。利巴韋林注射液半成品的質量檢測項目有pH值和含量測定，pH值的測定方法在此不做討論，主要討論含量測定。利巴韋林的含量測定的方法有定氮法 、液相色譜法[1]、反向高效液相色譜法、高效毛細管電泳法、旋光法[4]、紫外分光光度法[3]、高磺酸法等。這里對幾種常見簡便的方法進行比較，優化出一種適合生產中利巴韋林注射液半成品質量控制的方法。

從利巴韋林分子結構上可知具有紫外吸收性和旋光性，這與中國藥典2005年版二部上的利巴韋林性質一致。

利巴韋林注射液處方：利巴韋林100g；氯化鈉9g；藥用炭0.5g；注射用水加至1000mL。

在旋光光度測定方法中，通過對輔料進行旋光檢測，輔料沒有旋光度，對此種方法進行含量測定沒有影響。再分別用以上兩種方法測定利巴韋林注射液半成品的含量并與HPLC法測得含量進行對比優化出一種能夠保證準確性，節省時間，成本低，適合于利韋林注射液生產需要的方法對利巴韋林注射液半成品進行控制，并進行方法學考察。

1 實驗儀器與試劑

SSI2000型HPLC-UV：（美國聯盟實驗室）；AL104/01型電子天平：（瑞士梅特勒）；pHS 3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）；UV-1201紫外可見分光光度計（北京通用儀器設備公司）；WZZ-1型自動指示旋光儀（上海物理光學儀器廠）；利巴韋林對照品（中國藥品生物制品檢定所）；利巴韋林原料：（濟南明鑫制藥有限公司）【批號】 ；氯化鈉：（中鹽宏博集團云夢云虹制藥有限公司）【批號】；藥用炭：（上海活性炭有限公司）；利巴韋林注射液半成品規格：0.1mg/mL（濮陽市匯元藥業有限公司）【批號：081101，081102，081103】。

實驗用水均為超純水

2 實驗方法與結果

2.1 旋光光度法

2.1.1 檢測條件

利巴韋林具有旋光性，為左旋性物質，采用鈉光譜D線，波長為589nm 測定管長為20cm在20℃±0.15℃，以水為溶劑。

2.1.2 旋光度與濃度的線性關系

精密稱取經105℃干燥至恒重的注射用利巴韋林，加注射用水，分別配成40、80、100、120、140mg/mL的5種濃度的溶液，依照2.1.1中的方法測定旋光度。以旋光度為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，得到方程Y =-0.0743X-0.0981，（r=0.9999）。數據和線性圖見表1和圖1。

表1 標準曲線的制備

圖1 標準曲線（旋光）

2.1.3 精密度實驗

取以上5種濃度的利巴韋林溶液，照旋光光度測定法[1]測定旋光度，重復測定6次，計算標準相對偏差，見表2。

2.1.4 穩定性實驗

2.1.4.1 溫度對旋光度的影響

取不同溫度的以上5種濃度的溶液，分別測定旋光度結果，見表3。實驗結果表明，在10～30℃范圍溫度內對利巴韋林溶液的旋光度基本沒有影響。

表2 精密度實驗

表3 溫度對旋光度的影響

2.1.4.2 pH值對旋光度的影響

藥典規定利巴韋林注射液pH值范圍是4.0～6.0，取濃度為40mg/mL的利巴韋林溶液，分別用0.1mol/L的鹽酸溶液和0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調整至不同的pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0），測定旋光度，見表4。實驗結果說明pH值在4.0～6.0范圍內，利巴韋林注射液旋光度無變化。

表4 pH值對旋光度的影響

2.1.5 回收率實驗

根據以上配制方法配制濃度為40、80、100mg/mL的利巴韋林溶液，每種濃度的溶液各3份，根據中國藥典2005年版二部的旋光光度法，測定旋光度，并計算含量，結果見表5。

表5 回收率試驗

2.1.6 樣品的含量測定

取以上081101、081102、081103，三批利巴韋林注射液半成品，直接根據旋光光度法測定旋光度，并計算含量，見表6兩種方法含量比較。

2.2 HPLC法

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Hamilton HC-75 氫型陽離子交換柱（250×4.1mm，9μm）；流動相為超純水（pH用稀硫酸調至2.5±0.1）；流速為1mL/min，紫外檢測波長為207nm，柱溫25℃，檢測理論塔板數按利巴韋林峰計算不低于3000。

2.2.2 流動相的配制

取蒸餾水2000mL，加稀硫酸調節pH值到2.5，用0.45μm的濾膜抽濾，棄去初濾液，取續濾液，在超聲波中處理20min，作為流動相。

2.2.3 對照液的制備

取利巴韋林標準品12.5mg，精密稱定，置50mL的量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋液5mL，置25mL的量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 樣品含量的測定

取以上081101、081102、081103三批利巴韋林注射液半成品，精密量半成品5mL置100mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻。量取稀釋液1mL，置100mL量瓶中，加流動相稀釋到刻度，搖勻后，用0.45μm的濾膜抽濾，棄去初濾液。取續濾液，超聲波處理后按照上述色譜條件，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。與標準品的峰面積對比，計算含量。見圖2和圖3。

圖2 081103批半成品掃描圖譜

圖3 標準品掃描圖譜

表6 兩種含量測定方法的比較

把HPLC法和旋光法測得利巴韋林注射液半成品的含量同樣進行t檢驗，經計算t=1.5719。自由度df=（N1+N2-2）=4，查表[11]得t0.05（4）=2.776。t＜t0.05（4），沒有顯著性，說明旋光法可采用。

3 討論與分析

利巴韋林注射液的輔料為氯化鈉，在輔料對主藥吸收度的影響中附有掃描光譜，可見輔料對含量測定結果不產生實質性影響。為了簡化試驗操作，可以用蒸餾水作為空白。

根據處方的比例，配制成不含利巴韋林的對照液，經過旋光測定，證明沒有旋光性，輔料對主藥含量測定沒有影響。進行含量測定時可直接用蒸餾水作為對照校正。

通過對以上方法的含量測定結果分別與HPLC比較，旋光光度法的含量測定結果偏低。通過進行數理學T檢驗證明，沒有顯著性差異，兩種方法都可采用。

4 結 論

通過對以上方法的整體考察，旋光光度法與HPLC相比。HPLC法專屬性強，準確可靠，重復性好，但不適合利巴韋林注射液半成品的質量控制。旋光光度法比HPLC法相對節省了時間，操作更方便，均可用于利巴韋林注射液半成品的質量控制。

旋光光度法樣品檢測濃度不要求太低，利巴韋林注射液為0.1g/mL，濃度適宜，可直接進行旋光測定，此濃度測定結果誤差較小。其操作簡單，可直接用對照品測得校正因子后，照2005版中國藥典《旋光度測定法操作規程》依法測定，按下式計算，含利巴韋林（C18H12N4O5）應為標示量的93.0～107.0%。

含量%=α×校正系數×100%

此方法簡便，快速，適合本廠生產需要，縮短了配制到灌封的時間。旋光光度法是為適應本廠優化出來的較為理想的方法，通過此方法的優化，減少了化驗人員的勞動強度，降低了成本。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版(二部)[S].北京：化學工業出版社,2005：262.

[2]杜興,何英梅,羅西湘.利巴韋林片含量測定方法改進[J].中國藥事,2006,20(3)：171-172.

[3]林婉貞,劉怡,任斌,等.紫外分光光度法測定利巴韋林含片含量[J].天津藥學,2005,17(2)：29-31.

[4]范宇,王聯民.旋光法測定利巴韋林注射液含量方法探討[J].徐州醫學院學報,2005,25(2)：152-154.

[5]李安榮,許群芬,龔亞林.紫外分光光度法和高效液相色譜法測定利巴韋林片含量的比較[J].中國藥業,2004,13(12)：34-35.