高效毛細管電泳法測定清胃黃連丸中鹽酸小檗堿含量

黃玉芝，房娟娟，李 金，閆 濱

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

清胃黃連丸由黃連、石膏、桔梗、甘草、知母、玄參、地黃、牡丹皮、天花粉、連翹、梔子、黃柏、黃芩、赤芍14味中藥組方，功能清胃瀉火、解毒消腫，用于肺胃火盛所致的口舌生瘡、齒齦腫痛、咽喉腫痛[1]。鹽酸小檗堿是方中藥材的主要抗菌消炎成分，藥典中采用薄層色譜法測定其含量[1]，文獻[2]中采用反相高效液相色譜(RPHPLC)法測定。高效毛細管電泳(HPCE)法以其柱效高、分離速度快、樣品量小、儀器簡單等優點已在藥品檢驗及質量控制等方面得到了廣泛應用和較快發展。為此，筆者采用高效毛細管電泳法測定清胃黃連丸中鹽酸小檗堿的含量，報道如下。

1 儀器與試藥

P/ACE System 5500型高效毛細管電泳儀(美國Beckman公司);P/ACE UV Absorbance Detector檢測器，未涂敷熔融毛細管柱(47 cm×75 μm，河北永年光導纖維廠)。鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110713－200609);清胃黃連丸(水丸，批號091009，購于山東孔圣堂制藥有限公司);甲醇為色譜純試劑，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 電泳操作條件與系統適用性試驗

采用熔融毛細管柱(47 cm×75 μm)，有效長度40 cm;60 mmol/L磷酸緩沖溶液－甲醇(65∶35)，pH=3.0;紫外檢測波長200 nm;壓力進樣138 kPa×5 s;分離電壓30 kV;柱溫25℃。每天開機后先用0.1 mmol/L的氫氧化鈉沖洗5 min，再用純水沖洗5 min，最后用背景緩沖液沖洗5 min，再開始操作。每次進樣前后用背景緩沖液沖洗1 min，所用緩沖溶液超聲處理后以0.45 μm微孔濾膜濾過。在此條件下，色譜圖見圖1。

2.2 溶液配制

精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 g的對照品溶液。取清胃黃連丸9 g，研碎混勻，精密稱取3 g，用鹽酸－甲醇(1∶100)定容至100 mL，稱定質量，室溫放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)45 min后，放冷用甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。按處方工藝制備不含黃連的空白樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，分別置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至刻度，得不同質量濃度的對照品溶液。以對照品質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為 Y=34 301 X－1 235，r=0.999 7。結果表明，鹽酸小檗堿質量濃度在0.05～0.45 g/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗:取質量濃度為0.45 g/L的對照品溶液，連續進樣5次。結果的 RSD為1.59%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液20 mL，濃縮至1 mL，置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至10 mL，室溫下放置，每隔1 h進樣。結果的 RSD為2.3%(n=5)，表明供試品溶液中鹽酸小檗堿含量在5 h內穩定性良好。

重現性試驗:取批號為091009的樣品，依法制備供試品溶液，重復6次，在上述色譜條件下測定樣品含量。結果的 RSD=0.259%，表明方法的重現性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品，加入對照品適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，取20 mL，濃縮至1 mL，置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至10 mL，按優化的色譜條件進樣分析，測定鹽酸小檗堿含量，計算回收率。結果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(n=5)

2.4 樣品含量測定

取2.2項下供試品溶液，濃縮至1 mL，置10 mL量瓶中，加入2 mL緩沖溶液，用甲醇定容至刻度，按優化的色譜條件進樣分析。結果樣品中鹽酸小檗堿含量測定結果為標示量的0.34%(n=3)。因此，規定本品每1 g含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿(C20H18ClNO4)計，不得少于 3.4 mg。

3 討論

目前常用的鹽酸小檗堿定量方法有薄層色譜法[1]、紫外分光光度法[3]和高效液相色譜法[1]、高效毛細管電泳法等[4]。若試驗樣品成分復雜，前兩種方法的背景干擾大，重現性差[5]，存在系統誤差而定量不準，分離效率低。高效液相色譜法是目前最常用的方法，但用于測定鹽酸小檗堿時要實現良好的分離效果還存在一定難度;由于鹽酸小檗堿為季銨類生物堿，堿性強極性大，往往被色譜填料吸附，易造成色譜峰峰形不對稱、拖尾，通過改變流動相介質可以得到一定的改善，但對色譜柱的污染大，會降低其使用壽命[6]。高效毛細管電泳法可供分析帶有一定電荷的物質，而生物堿含有的氮原子上的孤電子對能接受質子而顯堿性，常攜帶正電荷，因此十分適用[7]，且開管柱容易清洗而不存在污染問題。采用高效毛細管電泳法測定清胃黃連丸中鹽酸小檗堿的含量，方法學考察顯示，方法簡便易行、準確可靠，可作為樣品的質量控制方法。

鹽酸小檗堿為季銨類生物堿，磷酸氫二鈉作緩沖液可使其保持帶有的正電荷。曾用50 mmol/L的硼砂－甲醇(85∶15)作緩沖液對黃連藥材進行預試驗，分離效果很好，但在測定清胃黃連丸中的鹽酸小檗堿時卻未能達到基線分離。也曾嘗試過以40 mmol/L硼砂－甲醇(85∶15)作緩沖液，未取得理想效果，不能實現基線分離。后選用60 mmol/L磷酸二氫鈉－甲醇(65∶35)作緩沖液，分離效果良好。

由于電滲流(EOF)對pH的強依賴性，導致出峰時間也對pH呈強依賴性，因此緩沖溶液的pH成為影響重現性的關鍵參數;同時由于離子的電泳淌度直接正比于其有效電荷，而離子的有效電荷受操作中緩沖溶液pH影響，故緩沖溶液的調節與控制是優化分離的重要對策[6]。在采用硼砂－甲醇(85∶15)緩沖體系時，pH在9.0左右，出峰時間短，但未能達到基線分離。改用磷酸二氫鈉緩沖體系后(調pH至3.0左右)出峰時間在5 min左右，而且有良好的分離效果。

黃連中含有的多種生物堿本身已帶有1個正電荷，因其結構差異不大，故需要在選擇的緩沖液中加入適當的有機改性劑，以降低緩沖液濃度，從而降低離子強度，抑制電滲流，并減少毛細管壁對陽離子的吸附，得到良好的分離效果。本試驗中通過加入一定比例的甲醇，實現了良好的分離。

改變毛細管柱長可用來改變出峰時間。一般來說，待測成分的出峰時間要控制在15 min以內。試驗中曾選定40，50，60 cm長的毛細管，40 cm柱長時出峰時間在5 min左右且有良好的峰形和分離度，后兩者雖具有更好的峰形和分離度，但出峰時間明顯延長。

綜上所述，在目前分析黃連藥材及其復方制劑較常用的幾種方法中，高效毛細管電泳法分離效率高，樣品需要量極少，使用簡單少量的緩沖液，幾乎不產生廢液，分析耗費低，樣品預處理簡單，尤其適合于分析基質比較復雜、結構近似的藥用植物成分。高效毛細管電泳法既可結合質譜技術建立復方藥物的指紋圖譜，又可進行多種有效成分或指標成分的定量，還可用于體內藥物分析、開展有效成分研究。雖然高效毛細管電泳法在重現性和檢測靈敏度方面尚不及高效液相色譜法，但通過采用相對遷移值與疊加對比法或內標法可以克服重現性差的弱點。因此，采用高效毛細管電泳法分離分析藥用植物成分，具有極廣闊的發展前景。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 (一部)[M].北京:化學工業版社，2005:570.

[2]李 嶸，羅 蘭，王建春.RP－HPLC法測定清胃黃連丸中小檗堿、掌葉防己堿的含量[J].海南醫學，1998，9(4):293 －294.

[3]薛慧清.分光光度法測定康爾樂洗劑中小檗堿類的含量[J].中國中藥雜志，2003，28(6):571 －572.

[4]張 藝，毛 平，李琴韻.毛細管區帶電泳法測定金黃散中鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬亭的含量[J].中成藥，2003，25(11):877－879.

[5]文欣欣，劉丹華，余陳歡，等.薄層色譜－熒光分光光度法測定黃連及香連丸中鹽酸小檗堿的含量[J].中國中醫藥信息雜志，2008，15(10):53－54.

[6]余 為，胡薏冰.高效毛細管電泳法測定紫黃止血消炎粉中鹽酸小檗堿的含量[J].中國實用醫藥，2008，3(15):72 －73.

[7]張 蕊，郭寶林.高效毛細管電泳技術用于生物堿的分析[J].中草藥，2005，12(36):1 889 －1 892.