品種、產地及采收期對野生益母草中生物堿成分的影響

黎耀東， 賈 蕓， 盧 軍

(新疆維吾爾自治區中醫醫院，新疆烏魯木齊830000)

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt．的新鮮或干燥地上部分。功效主治:活血調經，利水消腫，清熱解毒;治療水腫、小便不利，可單用，也可配白茅根、澤蘭等使用;治療水瘀互結，淤血障礙膀胱;可治療瘡癰腫毒，皮膚癮疹;活血調經，用于血滯經閉、痛經、經行不暢，產后惡露不盡、瘀滯腹痛等。益母草也廣泛應用于現代婦科中成藥制劑中，其婦科臨床療效毋庸置疑。現代藥理研究表明，益母草中主要有效成分為益母草堿、水蘇堿等多種生物堿，具有增強機體的細胞免疫作用;抗血栓形成的作用;對子宮有興奮作用;抗血小板聚集的作用;益母草制劑對心肌超微結構，特別是線粒體有保護作用，明顯地降低血液黏度。

據統計［1］，益母草屬植物全球分布，約20種，我國有12種和2個變種，廣泛分布于全國各地，主要生于山野荒地、田埂、河灘、草地、路旁、溪邊等處，部分地區有栽培。其中益母草 Leonurus japonicus Houtt．為藥用的主要植物，同時涉及藥用的還有細葉益 母 草 L．sibiricus Linu．Var．β．grandiflora Benth．，L．manshuricus Yabe、白花益母草 L．sibiricus Linu．Var．albiflorus Migo［2］。全國各地一般自產自銷，藥材質量難以控制，產量難以得到保證［3］。本實驗以總生物堿、鹽酸水蘇堿為考察指標，對影響益母草質量的品種、產地、采收期、部位等因素進行研究。

1 試驗部分

1．1 儀器和試藥

HPWaters2996高效液相色譜儀，SK25LHC型醫用數控超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司);紫外分光計Sintra20(日本);梅特勒-托利多萬分之一電子天平(梅特勒托力多儀器上海有限公司);HHS-4S電子數控式恒溫水浴鍋(上海康路儀器設備有限公司)。

鹽酸水蘇堿對照品(批號:712-200907，中國藥品生物制品檢定所);益母草均采自產地，品種由新疆醫科大學附屬中醫醫院中藥鑒定室李永和(主任中藥師)鑒定。

1．2 總生物堿測定方法

1．2．1 檢測波長的確定 配制一定質量濃度的對照品溶液，在200～760 nm進行掃描，可見光區于521 nm處有最大吸收。故選擇520 nm為檢測波長。

1．2．2 線性試驗 精密量取鹽酸水蘇堿對照品溶液(質量濃度為 1．0272 mg/mL)2．5、5、7．5、10、12．5，分別置25 mL 量瓶中，加 10 mL 0．1 mol/L 鹽酸溶液，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0．1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，作為鹽酸水蘇堿對照品溶液;另取0．1 mol/L鹽酸溶液20 mL，置另一25 mL量瓶中，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3mL，用0．1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，作為空白溶液;置冰水浴中放置1 h，用干燥濾紙濾過，取續濾液，以0．1 mol/L鹽酸溶液為空白，照紫外-分光光度法(附錄ⅤA)，在520 nm波長處分別測定吸收度，用空白試劑的吸收度分別減去對照品的吸收度，以吸收度的差值為縱坐標、濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。

結果表明，鹽酸水蘇堿在0．102 7～0．513 6 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，線性回歸方程為:Y=0．426 4X －0．001 0(R=0．999 6，n=5)。

1．2．3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過二號篩)約2 g，精密稱定，置100mL錐形瓶中，精密加水50 mL，稱質量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 KHz)，加水補足質量，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液20 mL，用稀鹽酸調節pH值至1～2后，再使其通過001×7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂柱(內徑2 cm，柱高15 cm)，用水洗脫至流出液呈中性，棄洗脫液，再用質量濃度2 mol/L氨溶液150 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用濃度0．1 mol/L的鹽酸溶液溶解并轉移至25 mL量瓶中，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0．1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，置冰水浴中放置1 h，用干燥濾紙濾過，取續濾液，即得。

1．3 鹽酸水蘇堿測定［4-12］

1．3．1 色譜條件 Phenomenex Luna scx色譜柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:0．05 mol/L 磷酸二氫鉀(含0．03%三乙胺和0．1%磷酸，pH 3);體積流量:1 mL/min，柱溫:30℃，波長:192 nm，進樣量10μL。鹽酸水蘇堿在上述色譜條件下與其他成分實現了基線分離，見圖1、2。

圖1 鹽酸水蘇堿HPLC圖

圖2 益母草HPLC圖

1．3．2 標準曲線的繪制 取鹽酸水蘇堿對照品適量，精密稱定，加0．1 mol/L鹽酸溶液制成1mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12μL進行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣量(Y，μg)對峰面積(X，mAu*sec)進行線性回歸，回歸方程為:Y=282．72X+214，r=0．999 8。

1．3．3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過二號篩)約2 g，精密稱定，置100mL錐形瓶中，精密加水50 mL，稱質量，超聲處理(功率 250 W，頻率 50 KHz)30 min，加水補足質量，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液20 mL，鹽酸調節pH值至1～2，通過D101 大孔樹脂(內徑 1．5 cm，柱高 10 cm)，以 0．1 mol/L鹽酸溶液150 mL洗脫，合并洗脫液;將上述洗脫液通過001×7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(內徑1．5 cm，柱高15 cm)，水洗至流出液呈中性，棄去水洗脫液;再用2 mol/L氨溶液150 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用0．1 mol/L鹽酸溶液溶解并轉移至5 mL量瓶中，加0．1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。精密吸取10μL，進樣，按上述色譜條件進行HPLC測定，即得。

1．4 部分產地益母草生物堿的比較

為了確定野生益母草中生物堿的量是否受產地影響，本研究實地收集了新疆部分縣市的野生益母草品種;同時，對我國主要藥材市場市售的益母草樣品進行采集分析，包括河北安國藥材市場、廣西玉林藥材市場、安徽亳州藥材市場、廣州清平藥材市場、浙江磐安藥材市場、黑龍江雞西藥材市場。

以上益母草樣品多為新鮮植物，切段，30℃烘至含水量10%左右，按照試驗1．2及1．3項中總生物堿測定方法及鹽酸水蘇堿測定方法，對各產地益母草樣品進行總生物堿及鹽酸水蘇堿的測定，結果見表1。

1．5 不同品種益母草生物堿的比較

為了考察不同品種對生物堿的影響，本研究在同一時期采集益母草及其常見習用品種細葉益母草、白花益母草，并進行總生物堿及鹽酸水蘇堿的測定，結果見表1。

表1 不同產地、不同品種益母草生物堿比較( ± s，n=3)

表1 不同產地、不同品種益母草生物堿比較( ± s，n=3)

產地 品種 采收期 總生物堿/% 水蘇堿/%新疆布爾津縣益母草 花初期(6月中)2．42 ±0．07 1．58 ±0．06新疆哈巴河縣白花益母草 花初期(6 月中)1．63 ±0．04 0．91 ±0．02新疆伊寧縣 益母草 花初期(6月中)0．88±0．09 0．34±0．04新疆霍城縣 白花益母草 花初期(6月中)1．47±0．03 0．79±0．03新疆福海縣 益母草 花初期(6月中)1．11±0．05 0．56±0．02新疆富蘊縣 細葉益母草 花初期(6月中)1．26±0．09 0．62±0．03新疆青河縣 細葉益母草 花初期(6月中)1．39±0．07 0．68±0．02廣州清平 益母草 花初期(干品) 0．95±0．03 0．49±0．02廣西玉林 益母草 花初期(干品) 0．71±0．02 0．33±0．01安徽亳州 益母草 花初期(干品) 1．51±0．02 0．64±0．02河北安國 益母草 花初期(干品) 1．77±0．04 0．81±0．03浙江磐安 益母草 花初期(干品) 1．42±0．02 0．63±0．03黑龍江雞西 益母草 花初期(干品)1．66 ±0．04 0．74 ±0．03

1．6 不同采收期益母草生物堿的比較

為了考察不同采收期對益母草生物堿的影響，本研究以采自新疆布爾津縣的益母草為考察對象，分別于盛葉期、花初期、花盛期、果初期、果熟期采集樣品，按照上述測定方法進行總生物堿及鹽酸水蘇堿的測定，結果見表2。

1．7 不同部位益母草生物堿的比較

為了考察益母草中生物堿的分布情況，本研究對花初期、花盛期、果熟期的益母草，對莖、葉、花序、果實等部位進行了總生物堿及鹽酸水蘇堿的測定，結果見表3。

表2 不同采收期益母草生物堿比較( ± s，n=3)

表2 不同采收期益母草生物堿比較( ± s，n=3)

產地 品種 采收期 總生物堿/%水蘇堿/%新疆布爾津縣 益母草全草盛葉期(6月初)2．73 ±0．06 1．84 ±0．08花初期(6 月中)2．42 ±0．07 1．58 ±0．06花盛期(6 月底)1．71 ±0．05 0．93 ±0．02果初期(7 月中)1．15 ±0．03 0．67 ±0．02果熟期(7月底)0．59 ±0．03 0．33 ±0．02

表3 不同部位益母草生物堿比較( ± s，n=3)

表3 不同部位益母草生物堿比較( ± s，n=3)

產地 物候期(采收期)部位 總生物堿/% 水蘇堿/%新疆布爾津縣 花初期(6月中) 莖0．67 ±0．02 0．23 ±0．01葉 5．84 ±0．08 2．68 ±0．05花序 3．07 ±0．06 1．74 ±0．04花盛期(6月底) 莖 0．43±0．02 0．11±0．01葉 3．23 ±0．05 1．47 ±0．04花序 2．17 ±0．04 0．93 ±0．07果熟期(7月底) 莖 0．18±0．01 痕量葉 1．97 ±0．03 0．86 ±0．02果穗0．41 ±0．02 0．17 ±0．01

2 結果及討論

2．1 表1表明，不同產地野生益母草中含生物堿量差異較大。可見，產地對益母草藥材質量影響較大，提示在挑選益母草藥材時應盡量考慮這一因素。由于條件所限，本研究僅能夠對新疆省內部分地區的野生益母草進行跟蹤采集，無法對其他省市的益母草樣品進行客觀評價。

2．2 比較我國幾個主要藥材市場銷售的益母草質量，發現生物堿含有量高低順序為:河北安國藥材市場＞黑龍江雞西藥材市場＞安徽亳州藥材市場＞浙江磐安藥材市場＞廣州清平藥材市場＞廣西玉林藥材市場，其中后二者鹽酸水蘇堿的量均低于藥典標準。與本研究所采集的新鮮益母草相比，購于藥材市場的益母草生物堿量明顯偏低，可能與益母草藥材的儲存時間有較大關系，有待進一步研究。

2．3 表1顯示新疆地區的益母草品種較為多樣，并對同一生長期采集的不同品種益母草樣品進行分析，發現益母草含有量最高，細葉益母草次之，白花益母草最低且均低于藥典標準。可見，品種對益母草中生物堿含有量的影響也比較大，藥材種植及采收時應予以足夠重視。

2．4 表2結果表明，不同采收期益母草的生物堿差別較大，以盛葉期與花初期的含有量最高，且隨著益母草的繼續生長，生物堿量逐漸下降，至果熟期時其生物堿量僅為花初期的1/5。提示各地在采收益母草藥材時，應在花初期時進行采收，即莖葉生長旺盛，花剛開放的時候。

2．5 表3結果表明，不同部位益母草生物堿含有量差別較大。其中，花初期時，以葉中生物堿最高，花序次之，莖最低;至花盛期時，各個部位的生物堿均明顯降低，但仍以葉最高;至果熟期時，各個部位的生物堿降低更為明顯，莖中生物堿甚至難以檢測到。提示益母草藥材以葉多、花序多為佳，個大莖粗并不代表其品質好。

2．6 表3中益母草的葉和花序的生物堿含有量相對較高，經分析，益母草葉質量占全草的35%左右，花序為5%左右，而益母草的莖占60%左右，但由于其生物堿含有量相對較低，故表2中全草中的生物堿量也相對較低。這也提示益母草的最佳采收期應在盛葉期至花初期。

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