全蝎勻漿提取工藝研究

侯 林， 田景振， 姬 濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250355)

全蝎始載于《開寶本草》，中國藥典收載的品種為鉗蝎科動物東亞鉗蝎Buthusmartensii Karsch的干燥體。辛，平;有毒。歸肝經(jīng)。具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛功能，臨床用于小兒驚風(fēng)、抽搐痙攣、中風(fēng)口?、半身不遂、破傷風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、偏正頭痛、瘡瘍、瘰癘等癥［1］。目前許多抗癌藥的成方中，全蝎常為主藥，由于有效成分不清楚，多以原粉入藥，少數(shù)用水、醇提取，全蝎的主要藥效成分為蛋白、多肽類，用常規(guī)的水醇法不能將其充分的提取而且易使其變性失活［2］。生藥粉末直接配藥存在制劑量大、水平低，無法制備高效制劑的缺點。本實驗采用全蝎勻漿后磷酸緩沖液提取的方法，在單因素考察的基礎(chǔ)上以蛋白含有量為指標(biāo)，利用正交試驗設(shè)計優(yōu)選了全蝎蛋白的提取工藝。

1 試驗材料與儀器

1．1 試驗材料 全蝎藥材購自蒙陰縣藥材公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系王厚偉副教授鑒定為鉗蝎科動物東亞鉗蝎Buthusmartensii Karsch。

1．2 試驗儀器 日立UV-3010紫外可見分光光度計(日本日立公司);JJ-2組織搗碎勻漿機(江蘇金壇市金偉實驗儀器廠);LD4-2A型低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);BS110分析天平(賽多利斯天平公司);恒溫震蕩水浴(深圳國華儀器)。

1．3 試劑 甲醇，冰醋酸、磷酸等均為分析純。

2 試驗內(nèi)容

2．1 提取工藝 將活全蝎洗凈晾干后，冰箱凍殺，取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)使用組織搗碎機勻漿后，按不同的條件用恒溫振蕩器冰水浴震蕩提取，提取液3 500 r/min離心15 min，連續(xù)提取3次，合并取上清液定容至250 mL。

2．2 樣品液的蛋白量測定［3］本部分采用280 nm光吸收測定樣品液中的蛋白量，該方法可以快速的對樣品液進行測定，該方法不是嚴(yán)格的定量但是對于本部分的蛋白量測定是合適的。

2．2．1 原理［4］蛋白質(zhì)分子中常含酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等含有苯環(huán)的氨基酸，苯環(huán)結(jié)構(gòu)在280 nm處有最大吸收，其吸收值與蛋白濃度成正比，故可以采用280 nm波長吸收值的大小來測定蛋白質(zhì)的量。

2．2．2 樣品液中的蛋白量測定方法 用試驗用的緩沖液調(diào)零，然后分別測定樣品在280 nm和260 nm下的吸光度，按以下公式計算蛋白量［5］:

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)=1．55×A280－0．75×A260

2．3 提取次數(shù)考察 中藥提取過程中，提取次數(shù)是影響提取率的關(guān)鍵因素，多次提取可以最大限度的將有效成分提取出來，但多次提取必然加大了提取難度故一般提取2～3次。本部分將全蝎分別提取3次，測定第3次提取蛋白的量來確定是否進行3次提取。

取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入50 mL的緩沖液恒溫振蕩器冰水浴震蕩提取1 h，提取液3 500 r/min離心15 min，取上清液定容至100 mL備用，分別提取3次，重復(fù)兩遍，樣品液測定吸光度并計算質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。

表1 提取次數(shù)考察結(jié)果

由上述結(jié)果可見，第3次提取的蛋白占總量的18．08%，且考慮到全蝎系貴重藥材，第3次提取應(yīng)該保留。

2．4 提取工藝單因素考察 根據(jù)經(jīng)驗影響本工藝的因素有加水量、提取時間和NaCl的濃度，由于用本工藝提取全蝎蛋白尚未見報道，需通過單因素試驗摸索其提取條件，確定各因素水平。

2．4．1 磷酸鹽緩沖液加入量考察 取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，分別加入 30、40、50、60、70、80 mL的緩沖液，2．1項下的工藝進行提取，每次1 h，提取液合并后測定吸光度并計算濃度，并平行操作3次，結(jié)果見圖1。

圖1 磷酸鹽緩沖液加入量考察結(jié)果

2．4．2 提取時間考察 取10 g冷凍全蝎加入10mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7．2)組織搗碎機勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入50 mL的緩沖液按2．1項下的工藝進行提取，分別提取 0．5、1、1．5、2、2．5 h，測定吸光度并計算濃度，并平行操作3次，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間考察結(jié)果圖

2．4．3 NaCl濃度的考察 取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，分別加入50 mL含有1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%NaCl的緩沖液按2．1項下的工藝進行提取，每次提取1 h，測定吸光度并計算濃度，并平行操作3次，結(jié)果見圖3。

圖3 NaCl濃度考察結(jié)果圖

2．5 正交試驗 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，確定以280 nm光吸收測定樣品液中的蛋白量為指標(biāo)，考察緩沖液加入量、提取時間、NaCl濃度三個因素對全蝎蛋白提取的影響，以L9(34)正交表進行試驗，每次試驗稱取冷凍全蝎10 g，以正交試驗表中各水平，按2．1項下的流程操作，得到提取液若干，按2．2項下的方法測定蛋白，因素水平見表2，正交試驗結(jié)果及方差分析見表3、表4。

表2 正交因素水平表

以280 nm光吸收測定樣品液中的蛋白量指標(biāo)，由表中的極差的大小顯示，各因素作用主次為:C因素(NaCl濃度)﹥B因素(提取時間)﹥A因素(PBS加入量)。表中的方差分析表明:C因素(NaCl濃度)的影響有顯著性意義。從直觀分析得知最佳提取工藝組合為:A3B3C2。但從生產(chǎn)的實際上考慮，為了節(jié)省緩沖液的用量，提高生產(chǎn)效率，采用A2B2C2，即加入5倍量的緩沖液、每次提取1 h，NaCl濃度5%，提取3次。

2．6 驗證性試驗 取10 g冷凍全蝎加入10mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7．2)組織搗碎機勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入50 mL含有5%NaCl的緩沖液分別恒溫振蕩器冰水浴震蕩提取1h，提取液3 500 r/min離心15 min，取上清液備用，殘渣按前法繼續(xù)提取，共提取3次，定容至250 mL，測定吸光度并計算濃度，結(jié)果見表5。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析

表5 驗證性試驗結(jié)果

3 討論

本研究根據(jù)蛋白質(zhì)的相關(guān)特性，利用稀鹽促進蛋白質(zhì)溶解的原理，使用低濃度的氯化鈉緩沖液對全蝎勻漿液進行抽提，通過單因素考察試驗和正交試驗確定的最佳提取工藝為取冷凍全蝎加入等量的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機勻漿，加入5倍量含有5%NaCl的緩沖液冰水浴提取1h，提取液3 500 r/min離心15 min，取上清液備用，殘渣按前法繼續(xù)提取，共提取3次。該工藝操作方便，適用性好，可以直接應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。

目前許多抗癌藥的成方中，全蝎常為主藥［6］，由于有效成分不清楚，在中成藥生產(chǎn)工藝中全蝎基本是生藥粉末直接配料，少數(shù)用水、醇回流提取［7～8］，由于全蝎的有效成分主要為蛋白類物質(zhì)及其水解產(chǎn)物，常規(guī)的水、醇提取不能充分的提出這些大分子物質(zhì)，而且經(jīng)過加熱處理使大量的蛋白類有效成分變性失活，不利于有效物質(zhì)的保留，采用生藥粉末直接配料存在制劑水平低下和微生物超標(biāo)的問題，孟琳等［9］比較了對全蝎水提取工藝、乙醇提取工藝和勻漿提取工藝的蛋白得率以及抗驚厥藥效進行了比較，結(jié)果證明勻漿提取工藝的蛋白得率比傳統(tǒng)提取工藝高十倍以上，抗驚厥作用也明顯強于傳統(tǒng)提取工藝。將勻漿提取工藝應(yīng)用與中藥全蝎的提取將解決制約含全蝎中藥制劑發(fā)展的瓶頸問題，同時也可以應(yīng)用與其他相關(guān)動物類中藥的提取過程中。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典2010版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:133．

［2］譚銀合，郭建生．全蝎的化學(xué)成分及其鎮(zhèn)痛作用的研究進展［J］．湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報，2001，7(5):210-212．

［3］王家政，范 明主編．蛋白質(zhì)技術(shù)手冊［M］．北京:科學(xué)出版社，2000:20．

［4］Wetlaufer D B．Ultratiolet spectra of proteins and amino acids［J］．Adv Prot Chem，1962:303-309．

［5］Schleif R F，Wensink P C．Pratical methods in molecularbiology［M］．New York，Springer-Ver．1981:217-219．

［6］鄭希林，張洪生．全蝎制劑的臨床應(yīng)用［J］．時珍國醫(yī)國藥，2000，11(9):853．

［7］譚銀合，曹道忠，郭建生．全蝎蝎毒蛋白的提取工藝研究［J］．湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報，2001，7(6):287-289．

［8］林 超，王玉蓉，吳 清，等．全蝎的酶解工藝研究［J］．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，28(6):66-69．

［9］孟 琳，姬 濤，侯 林，等．全蝎勻漿提取工藝的研究［J］．中草藥，2010，41(4):577-580．