滋陰經方經TGF-β途徑抑制小鼠自發乳腺癌生長的機理

鄭里翔， 林棟美， 劉紅寧， 余世平

(江西中醫學院，江西南昌330004)

乳腺癌是嚴重危害廣大婦女的健康最常見的惡性腫瘤之一。目前國內外對乳腺癌的治療，仍以手術為主，化療、放療、激素和免疫等治療法，但這些療法常嚴重影響患者的生存質量和生存期。而中醫藥在防治乳腺癌方面的優勢日益突顯，如可減毒增效、增加患者的生存期和生存質量。中醫學認為，乳腺癌發病機制是正虛邪實、虛實夾雜之癥，病變與肝腎脾及沖任有密切關系，其中正氣不足是乳腺癌發生的主要原因，肝郁脾虛、沖任失調是發生發展的重要因素，而邪氣入侵則是重要條件。中醫的臨床實踐已經證明:乳腺癌患者，無論是在發病前、手術后以及放化療后均會出現陰虛，可見陰虛貫穿于乳腺癌的發生、發展的整個過程，這為中醫藥防治乳腺癌提供了重要的思路。可見滋陰是防治乳腺癌重要的手段。六味地黃丸是滋陰名方，有大量的有關防治乳腺癌報道［1-5］。前期實驗也已證實:該方可抑制自發乳腺癌的生長，但目前該方的作用機理尚不清楚。一系列的實驗研究表明:TGF-β信號途徑在人類乳腺癌的發展過程中起到關鍵性的作用，它的表達水平的高低與乳腺癌的輕重有直接的關系［6-7］。故本研究將從TGF-β/ERK信號途徑入手，研究六味地黃丸的作用機理。

1 實驗材料

1．1 試劑 六味地黃丸購自北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠(批號:北京同仁堂，國藥準字Z11021283，每粒0．2 g，每瓶裝360粒);Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，PCR引物由上海生工合成，兔抗 TGF-β、p-ERK1/2(ERK1p44，ERk2p42)單克隆抗體購于 SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC，辣根過氧化物酶標山羊抗兔IgG單克隆抗體購于北京中杉金橋公司，其他化學試劑都是國產分析純試劑。

1．2 儀器 ZT-12P生物組織自動脫水機 ，YB-6D生物組織石蠟包埋機，RM2235切片機 LEICA，YT-6C生物組織攤烤片機;OLYMPUS電子顯微鏡 (日出)，PCR擴增儀(美國)、BIO-RAD垂直電泳儀 (美國)，凝膠成像系統(美國Alpha)，高速冷凍離心機(日本)，PCR儀(美國)，核酸蛋白質分析儀(Eppendorf)。

1．3 實驗動物及分組 清潔級昆明小鼠360只，雌性種鼠，已產仔若干代，小鼠鼠齡約為11．5月，平均體質量38～40 g，由江西中醫學院動物中心提供(合格證號ZDW-NO．2007-170)。購買后，在封閉環境中、自然光線下進行飼養，保持室內溫度18～22℃，相對濕度50% ～60%，小鼠自由進水。每3天觸診乳腺部位一次，發現腫塊［8］，隨機分成六味地黃丸［分高劑量組4．6g/(kg·d)、低劑量組 2．3g/(kg·d)］和對照組，六味地黃丸水蜜丸，于無菌室內將120粒藥丸放入消毒研缽，加100 mL消毒蒸餾水研磨后，裝入消毒容器內，配成終質量濃度為0．24 g/mL，置于4℃冰箱備用。按成人劑量12 g/d換算成小鼠給藥劑量，患瘤小鼠給藥劑量為高劑量4．6 g/(kg·d)，低劑量為2．3 g/(kg·d)。六味地黃丸組灌胃給藥，直至患瘤小鼠瀕死期(癥狀:小鼠極度消瘦，精神萎靡，飲食明顯減少，表現為反應遲鈍，心跳減弱，呼吸微弱，或出現周期性呼吸)，對照組(發瘤未給藥)、正常組(未發瘤小鼠)灌胃生理鹽水(對照組給生理鹽水平均時間為59d;低劑量組給藥時間為83d;高劑量給藥時間為80．7d)，處死，記錄發瘤至瀕死期時間，剝離瘤塊，稱質量。留取部分行病理組織切片確診(光鏡下可見癌細胞排列呈片狀、巢狀，少部分癌細胞排列呈腺管樣，癌細胞核漿比例增大，胞核可見核分裂像)。

2 實驗方法

2．1 乳腺癌組織病理分析 取新鮮的癌組織用體積分數為4%的多聚甲醛固定，分別用85% 、95%酒精、無水酒精逐漸脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，切片與貼片，HE染色，X400觀察并拍照。

2．2 半定量的RT-PCR 按照TRIZOL試劑說明書提取總RNA，在20μL反轉錄反應體積中進行反轉錄，合成cDNA，取上述逆轉錄產物PCR擴增。TGF-β、p-ERK上下游引物為:p-ERK1/2:F:5 ＇-TGCACCGTGACCTCAAGCCTT-3 ＇，R:5 ＇-GGCCAGAGCCTGTTCAACTTCAAT-3＇，擴增產物長度491bp;TGF-β1 F:5 ＇-GCAATGGGCTTAGTGTTCTGGGT-3 ＇，R:5 ＇-TGCCTTCCTGTTGGCTGAGTT-3＇，擴增產物長度 295bp;β-actin F:5 ＇-CGTGCGTGACATTAAAGAC-3 ＇，R:5 ＇-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3＇，擴增產物長度 476bp。

25μLPCR反應體系中進行PCR反應(擴增條件為:p-ERK mRNA:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環，72℃終延伸5 min;TGF-β1 mRNA:95℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃終延伸5 min)。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠溴化乙錠電泳分離，用凝膠圖形分析系統進行拍照，觀察結果并測定灰度值，以擴增的目的條帶和同時擴增的β-actin的灰度值比對各基因轉錄水平進行衡量。

2．3 蛋白印跡 用SDS-PAGE電泳，半干轉印100 mA 40 min，4℃冰箱封閉過夜，與特異性抗體結合:將一抗用封閉液稀釋至適當濃度(兔抗TGF-β1稀釋比例為1∶400，小鼠抗p-ERK稀釋比例為1∶400);室溫下孵育1～2 h后或4℃冰箱孵育過夜，隨后用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min。將二抗用封閉液稀釋至適當濃度(辣根過氧化物酶標山羊抗兔IgG稀釋比例為1∶25 000，辣根過氧化物酶標山羊抗小鼠IgG稀釋比例為1∶25 000)，取3 mL稀釋液與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后或4℃冰箱孵育過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min，進行化學發光反應，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和以β-actin為內參進行上述蛋白的半定量分析。

2．4 統計學處理 應用SPSS15．0統計軟件，進行LSD檢驗，數據采用均數±標準差(± s)表示。

3 結果

3．1 病理分析確診乳腺癌 經HE染色后，正常小鼠乳腺細胞形態完整，腺管豐富(圖1A);對照組細胞數量較多，呈松散、紊亂樣排列，以散在和(或)小細胞群為主，腺管消失，細胞核大深染，核多形，層次增多，細胞異型性大，細胞排列雜亂無極性核，大小差異明顯(見圖1B)，為典型的乳腺癌。

圖1 不同組乳腺病理形態(10×40)

3．2 六味地黃丸對腫瘤瘤質量的影響 經六味地黃丸治療后，瘤質量明顯下降(P＜0．01)，說明六味地黃丸能明顯抑制腫瘤的生長(見圖2)。

3．3 六味地黃丸對瘤體內TGF-β、p-ERK基因表達產物的影響 實驗結果表明:六味地黃丸能明顯抑制瘤體中的TGF-β、p-ERK 基因的表達(P ＜0．01或 P ＜0．05)。見表2。

圖2 六味地黃丸對荷瘤小鼠瘤質量的影響與對照組比較*P＜0．05

表2 六味地黃丸對瘤體內TGF-β、p-ERK基因表達的影響 ( ± s)

表2 六味地黃丸對瘤體內TGF-β、p-ERK基因表達的影響 ( ± s)

注:與對照組比較，*P ＜0．01。

組別 劑量/(g/kg) mRNA 的表達量TGF-βp-ERK蛋白表達量TGF-βp-ERK正常組 0．66 ±0．14(15) 0．50 ±0．13(15) 0．47 ±0．08(14) 1．23 ±0．12(16)對照組 － 1．32 ±0．15(16) 1．14 ±0．14(16) 1．16 ±0．10(16) 3．83 ±0．16(16)六味地黃高劑量組 2．3 0．90 ±0．13*(15) 0．79 ±0．16*(15) 0．74 ±0．06*(15) 2．72 ±0．19*(15)六味地黃低劑量組 4．6 0．77 ±0．09*(16) 0．59 ±0．11*(16) 0．56 ±0．07*(16) 1．37 ±0．11*(16)

4 討論

目前中醫藥治療乳腺癌的方法主要有大補氣血、健脾和胃、滋陰補腎、活血養血、清熱解毒。黎壯偉等［10］根據晚期乳腺癌的病理特點及疾病發展的不同時期，將乳腺癌分為5型，對于其中肝腎虧虛型者，擬滋補肝腎、調和沖任，方用六味地黃丸加味;周斌等［11］認為乳腺癌骨轉移的病因主要是腎虛，加之氣血兩虛，使其易被癌瘤所侵襲而發病，因此防治乳腺癌常采用以溫補腎陽、滋補腎陰、平衡陰陽、調理氣血法為主，臨床實踐已證實:六味地黃丸能改善乳腺癌患者的臨床癥狀，提高患者的生存質量和延長患者的生存期［3-4］。

圖2的結果表明:六味地黃丸能明顯抑制乳腺癌的生長(P＜0．05)，這是因為方中的熟地黃、山藥、山茱萸均能提高機體免疫機能、誘導干擾素產生、抗氧化、抑制腫瘤生長;牡丹皮有調節免疫細胞作用;茯苓具有抗炎的功能［5］，諸藥合用達到抑制腫瘤生長目的。

同時六味地黃丸能明顯抑制腫瘤組織內的TGF-β/p-ERK的基因表達(P＜0．01或P＜0．05)。研究表明:從果蠅到人類均有TGF-β信號轉導途徑，TGF-β激活受體，進一步激活ERK。ERK屬于酪氨酸蛋白激酶，是MAPK家族主要的和經典的成員，主要傳遞細胞絲裂原信號，促進細胞增殖。p-ERK是其活化形式。激活的ERK可促進細胞漿靶蛋白磷酸化或調節其它蛋白激酶的活性。更重要的是激活的ERK進入核內，促進多種轉錄因子磷酸化，增強轉錄活性，它們所參與的信號傳導通路的過度活化與細胞的惡性轉化有關［6-7］。故六味地黃丸抑制TGF-β/p-ERK基因的表達，從而抑制了乳腺癌進一步的發展。

由于動物自發性腫瘤從其發生發展來看與人類腫瘤更相似，因而更適用于研究人類腫瘤。該模型最大的特點是實驗動物未經任何有意識的人工處理，生存到一定年齡便自然發生乳腺腫瘤，排除了很多人為的干擾因素，使得影響腫瘤發生發展的因素更有可能被發現，因而更具有研究價值和前景［9］。

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［5］何立麗．孫桂芝治療乳腺癌經驗［J］．北京中醫藥，2009，28(1):18-19．

［6］Ganapathy V，Ge R，Grazioli A，etal．Targeting the transforming growth factor-beta pathway inhibits human basal-like breast cancer metastasis［J］．Mol Cancer，2010 ，26(9):122-128．

［7］Stuelten C H，Busch J I，Tang B，et al．Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in amouse xenograftmodel of breast cancer［J］．PLoSOne，2010 ，5(3):e9832．

［8］施新猷主編．醫學動物實驗方法［M］．北京:人民衛生出版社，1980．

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