應(yīng)用高速逆流色譜一次性分離白豆蔻中5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮

朱云霞， 劉 雯， 張繼全， 沈平孃*， 王玲玲， 卓 超

(1．華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237;2．國(guó)家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海201203)

白豆蔻又名白蔻、豆蔻，為姜科植物白豆蔻Amomum kravanh Pierre ex Gagnep或爪哇白豆蔻Amonum compactum Soland．ex Maton的干燥成熟果實(shí)，按產(chǎn)地不同分為“原豆蔻”和“印尼豆蔻”。其性溫、味辛，歸肺、脾胃經(jīng)，有溫中止嘔、化濕行氣之功效。主治濕阻所滯、脾胃不和、脘腹脹滿、不思飲食、濕溫初起、胸悶不饑、胃寒嘔吐、食積不消，白豆蔻是臨床常用的芳香化濕藥［1］。

白豆蔻和爪哇白豆蔻多以果實(shí)入藥，含揮發(fā)油和黃酮類成分，普遍認(rèn)為主含揮發(fā)油，白豆蔻揮發(fā)油中主要成分為 1，8-桉葉素，此外，含有 β-蒎烯，α-蒎烯，丁香烯，龍腦乙酸酯，α-松油醇、芳樟醇、葛縷酮、金合歡醇、及對(duì)聚傘花素等。白豆蔻中黃酮類成分主要是指甲基化的黃酮醇類化合物，包括5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、3，7-二羥基-5，4'-二甲氧基黃酮、3-羥基-5，7，4'-三甲氧黃酮、5，4'-二羥基-3，7-二甲氧基黃酮、3，5，7，4'-四甲氧基黃酮、3，7-二羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮、5，3'-二羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮、3，5-二羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、3，5，3'-三羥基-7，4'-二甲氧基黃酮、3，5，7，3'，4'-五甲氧基黃酮等［2-3］。據(jù)藥理學(xué)表明，5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮具有防癌、抗癌、抗氧化、抗過(guò)敏、抗病毒、抗真菌等多種生物活性。可見(jiàn)，研究此類化合物的分離純化具有較重要的意義［4］，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖 1 5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮Fig．1 Chem ical structures of 5-hydroxy-3，7，4'-trim ethoxyflavone

黃酮醇類化合物的分離純化方法很多，常見(jiàn)的有柱層析、薄層層析、鉛鹽沉淀、硼酸絡(luò)合、pH梯度萃取、溶劑萃取等，近年來(lái)，高速逆流色譜技術(shù)在天然黃酮醇類活性成分的分離與純化領(lǐng)域中應(yīng)用越來(lái)越多［5］。

高速逆流色譜(High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種新型液-液分離技術(shù)，它避免了樣品的不可逆吸附、損失和污染。由于使用的是溶劑體系，其組成和配比可以無(wú)限多，從理論上講可以適合于任何極性范圍的樣品分離，具有很好的適應(yīng)性;它對(duì)樣品的預(yù)處理要求較低，一般的粗提物即可分離，分離效率高、重現(xiàn)性好［6-7］。由于其分離的快速性及被分離物質(zhì)回收的便捷性使得分離、純化、制備可同步完成，近年來(lái)，HSCCC已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物工程、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等各領(lǐng)域的分離制備，如黃酮類化合物、生物堿、木脂素、蒽醌、大環(huán)內(nèi)脂類、抗生素和胡蘿卜素類等天然活性成分的分離制備，并將HSCCC與質(zhì)譜(HSCCC/MS)聯(lián)用，分析鑒定生物堿、木脂素及三萜類化合物等，均取得了滿意的結(jié)果［8-9］。本實(shí)驗(yàn)首次采用HSCCC，選擇出合適的溶劑體系，從白豆蔻中分離出黃酮醇類成分，且用此方法一次性制備得到了高純度的5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮純品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

TBE-300A型高速逆流色譜儀(上海同田生化有限公司)，?KTA purifier P-900泵，UV-900紫外檢測(cè)器(美國(guó) GE Healthcare)，HX-1050恒溫循環(huán)器(北京博醫(yī)康)，Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括DAD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)。

正己烷、乙酸乙酯、甲醇為分析純，水為超純水，HPLC所用甲醇為色譜純?cè)噭锥罐⑺幉挠缮虾？禈蝻嬈邢薰咎峁?/p>

1．2 白豆蔻粗提物的制備

將白豆蔻粉碎為粗粉，取200 g粗粉加入1600 mL甲醇，回流提取3 h后，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸干，得棕黃色浸膏16．3 g，作為進(jìn)樣物備用。

1．3 HSCCC的分離操作

兩相溶劑體系選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶4∶8∶4)進(jìn)行HSCCC分離操作，使用前用分液漏斗分開(kāi)上下相，過(guò)濾，超聲處理20 min。將體積比為4∶1的上、下相溶液以10 mL/min的體積流量泵入管路，約20 min后停泵，啟動(dòng)并調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為900 r/min，然后以1．2 mL/min的體積流量將下相泵入柱內(nèi)，待上下相建立動(dòng)態(tài)平衡，記錄上相被推出的體積，得上相保留著為67．5%［10］;白豆蔻粗提物用下相溶解，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣;設(shè)定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm，接收目標(biāo)成分，減壓蒸干，TLC、HPLC分析分離結(jié)果。

1．4 HPLC 分析條件

色譜柱:CAPCELL PAK C18柱(4．6 mm ×250 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇-水(78∶22);體積流量1．0 mL/min;柱溫:室溫;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):274 nm;進(jìn)樣量為10μL。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 HSCCC條件的選擇與優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)化合物為中等偏弱極性，因此選用了三個(gè)體系進(jìn)行選擇與優(yōu)化，即正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-水及環(huán)己烷-甲醇-水。分配系數(shù)K值［11］由HPLC分析測(cè)定:將適量的粗提物放入等體積混合的上下相混合均勻，用HPLC分別檢測(cè)上、下相中目標(biāo)化合物的峰面積，分別記為AU和AL，則K=AU/AL。最終K值取三次測(cè)定的平均值，結(jié)果列于表1。

表1 樣品組分在各溶劑體系中分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果Tab．1 K values of two components in some two-phase solvent systems

綜合K值和實(shí)際分離情況，發(fā)現(xiàn)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶4∶8∶4)對(duì)目標(biāo)化合物的分離度最高，且出峰時(shí)間合適，上相保留大，因而采用該體系作為HSCCC分離的體系條件。

實(shí)驗(yàn)還研究了轉(zhuǎn)速、體積流量及溫度對(duì)分離效果的影響，最終選用轉(zhuǎn)速為900 r/min、體積流量為1．2 mL/min、溫度為室溫。HSCCC-UV圖譜如圖2所示，進(jìn)樣30min后開(kāi)始出峰，3 h內(nèi)出4個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)收集流出液進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

采用薄層色譜對(duì)4號(hào)峰進(jìn)行分析，展開(kāi)劑為三氯甲烷-丙酮(16∶4)，用香草醛-濃硫酸溶液(5%香草醛乙醇溶液與濃硫酸以4∶1比例混合)顯色，為單一的橙紅色斑點(diǎn)［12］。

采用上述方法，對(duì)4號(hào)峰經(jīng)多次分離、富集后，將收集所得組分蒸干后最終得到3．41 g的淡黃色針狀結(jié)晶，所得收率為1．71%。

2．2 結(jié)構(gòu)鑒定

2．2．1 核磁共振(NMR)對(duì)HSCCC分離峰的結(jié)構(gòu)分析 1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ:12．68(1H，s，5-OH)，8．08(2H，d，J=11，H-2'，H-6')，7．03(2H，d，J=11．5，H-3'，H-5')，6．45(1H，d，J=2．5，H-8)，6．36(1H，d，J=2．5，H-6)，3．92(3H，s，OCH3)，3．89(3H，s，OCH3)，3．87(3H，s，OCH3)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ:178．8(C-4)，165．4(C-7)，162．0(C-4')，161．68(C-5)，156．76(C-9)，155．97(C-2)，138．87(C-3)，130．17(C-2'，C-6')，122．82(C-1')，114．06(C-3'， C-5')，106．06(C-10)，97．82(C-6)，92．16(C-8)，60．1(3-OCH3)，55．8(4'-OCH3)，55．4(7-OCH3)。對(duì)比參考文獻(xiàn)［13-15］，可確定為 5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮。

2．2．2 質(zhì)譜(ESI-MS)對(duì)HSCCC分離峰的結(jié)構(gòu)分析 ESI-MS:m/z(%):328(［M］+，100)，329(15)，327(85)，309(12)，285(32)。以上數(shù)據(jù)與5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮的相對(duì)分子質(zhì)量吻合。

2．3 純度分析

將目標(biāo)成分按照上述HPLC色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)面積歸一化法，純度達(dá)到98%以上，結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

2．4 回收率計(jì)算

采用外標(biāo)法可以計(jì)算得到藥材中5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮的實(shí)際含有量，取三次計(jì)算的平均值為1．79%。將分離得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的量(1．71%)除以1．79%，即可得到5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮的回收率為95．5%。

3 討論

常規(guī)的分離技術(shù)，HSCCC技術(shù)預(yù)處理簡(jiǎn)單方便，耗時(shí)短，分離純度高，回收率高。在以后的應(yīng)用過(guò)程中，可采用HSCCC與常規(guī)分離方法相結(jié)合，進(jìn)一步提高分離效率，使其更廣泛的應(yīng)用于中藥分離領(lǐng)域。

圖3 白豆蔻粗提物(A)及HSCCC分離峰4(B)的HPLC圖譜Fig．3 HPLC chrom atogram s of crude extract from A．kravanh Pierre ex Gagnep(A)and HSCCC peak fractions4(B)

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