高脂飲食+STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型大鼠表征及其證候動(dòng)態(tài)演變研究*

吳 晏，韓 靜，黃黎明，郭淑貞，王 偉

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

高脂喂養(yǎng)合并腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）是目前應(yīng)用較多的2型糖尿病大鼠模型的制備方法。采取2次注射 STZ法，成模率高，死亡率低，且成模穩(wěn)定［1、2］。本研究復(fù)制此種動(dòng)物模型設(shè)計(jì)觀察量表，連續(xù)12周全面、動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)物的表征變化并判定其證候?qū)傩裕耘袛啻朔N動(dòng)物疾病模型在不同病變階段是否存在不同的表征和證候特點(diǎn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性5周齡 SD大鼠40只，體質(zhì)量120g±10g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)為SCXK（京）2006-0001），飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫18℃ ～25℃，相對(duì)濕度50％ ～60％，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 飼料

普通飼料和高脂飼料均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所加工提供。高脂飼料配方：豬油12％，蛋黃粉10％，蔗糖10％，維持飼料68％。

1.3 試劑

檸檬酸（批號(hào) 0602102），檸檬酸鈉（批號(hào)20070403），購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；STZ，Sigma公司。

2 方法

2.1 STZ 配制

配制0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，調(diào)節(jié)pH為4.4；配制 1％STZ溶液，溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，在冰浴中操作。

2.2 分組

按體質(zhì)量將40只大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組2組，每組20只。

2.3 造模方法

正常組給予普通飼料，模型組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，給予高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，模型組第1次腹腔注射 STZ溶液35mg/kg，正常組腹腔注射同等劑量0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。第 1次注射STZ后2周，模型組大鼠再次腹腔注射 STZ溶液35mg/kg；正常組腹腔注射同等劑量 0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖（FBG），并進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）［3］，凡空腹血糖值≥7.8mmol/L者納入實(shí)驗(yàn)［2］。空腹血糖值 ＜7.8mmol/L者按照原劑量再腹腔注射1次STZ。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 表征采集 表1顯示，課題組根據(jù)大鼠表征采集表對(duì)2組大鼠逐一觀察并判斷，從STZ注射前1周開始每周觀察1次。如遇分歧采用其中2人的相同觀點(diǎn)。

2.4.2 觀察指標(biāo) 各組每2周測(cè)量1次體質(zhì)量、24h飲食量、飲水量；注射 STZ前1d各組經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FIN）、總膽固醇（TG）、甘油三酯水平（TC），并測(cè)定 OGTT。2次STZ注射后第2、6周，各組大鼠尾靜脈采血測(cè)定FBG并測(cè)定 OGTT。2次STZ注射后第10周測(cè)定各組動(dòng)物的 OGTT，然后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血檢測(cè) FBG、FIN、TG、TC水平，并處死所有動(dòng)物。血糖采用美國(guó)強(qiáng)生公司的onetouch隨手測(cè)血糖儀及血糖試紙測(cè)定。血清胰島素采用中國(guó)原子能科學(xué)研究院I1252胰島素放射免疫分析藥盒測(cè)定，用大鼠標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。血清 TC、TG由全自動(dòng)生化分析儀完成測(cè)定。

2.4.3 OGTT 大鼠禁食 15h后，灌胃給予20％的葡萄糖溶液2g/kg。檢測(cè)0min及葡萄糖灌胃后30、60、120min的血糖，計(jì)算葡萄糖曲線下面積（AUC）=（血糖值0min+血糖值 30min）×0.5/2+（血糖值30min+血糖值 60min）×0.5/2+（血糖值60min+血糖值120min）×1/2。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用 珋x±s表示，組間比較用 One Way Anova方差分析。

2.6 判斷標(biāo)準(zhǔn)

大鼠表征屬性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)診斷學(xué)》［4］。

3 結(jié)果

3.1 糖尿病大鼠的一般特征

表1 大鼠表征觀察量表

表2、3顯示，注射 STZ之前，模型組大鼠 FIN、TG水平明顯高于正常組大鼠水平（P＜0.05）；同正常對(duì)照組相比，模型組大鼠 FBG、空腹血清 TC水平無明顯差異（P ＞0.05）。

2次STZ注射后第2、6周，模型組大鼠FBG值均顯著高于正常組大鼠水平（P＜0.01）。2次 STZ注射后第10周，模型組大鼠 FBG、空腹血清 TG、TC值均明顯高于正常組水平（P＜0.05，P＜0.01），模型組大鼠FIN值與正常組相比無明顯差異（P＞0.05）。

3.2 大鼠葡萄糖耐量結(jié)果的比較

表4顯示，注射STZ之前，模型組大鼠與正常組大鼠的AUG水平無明顯差異（P＞0.05）；2次 STZ注射后第2周直至第10周，模型組大鼠的 AUG水平均顯著高于正常組大鼠（P＜0.01）。

表2 大鼠 FIN、TG和 TC水平的比較

表3 大鼠FBG水平的比較

表4 大鼠葡萄糖耐量結(jié)果的比較

3.3 大鼠的體質(zhì)量變化

表5顯示，注射STZ之前，模型組大鼠與正常組大鼠的體質(zhì)量水平無明顯差異（P＞0.05）；第1次 STZ注射后7d直至2次 STZ注射后第10周，模型組大鼠的體質(zhì)量水平均顯著低于正常組大鼠（P＜0.01）。

表5 不同時(shí)間2組大鼠體質(zhì)量、24h進(jìn)食量、24h飲水量的比較

3.4 大鼠24h進(jìn)食量和飲水量的變化

表5顯示，注射STZ之前，模型組大鼠與正常組大鼠24h進(jìn)食量和飲水量無明顯差異（P＞0.05）；第1次STZ注射后7d直至2次STZ注射后第10周，模型組大鼠的24h進(jìn)食量和飲水量均明顯高于正常組大鼠（P ＜0.05，P ＜0.01）。

3.5 2組大鼠表征變化的比較

模型組大鼠在2次 STZ注射后第1～4周出現(xiàn)活動(dòng)次數(shù)增加比率、背溫升高比率、各自爬臥比率、舌色鮮紅比率、舌干少津比率、爪干燥或脫屑比率升高，并與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。

模型組大鼠在2次注射STZ后6～10周出現(xiàn)活動(dòng)次數(shù)減少比率、毛潮濕比率、舌色鮮紅比率、舌干少津比率升高，并與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。

表6顯示，在第 1次注射 STZ后7d直至2次STZ注射后10周，模型組大鼠的尿量增加比率始終顯著高于正常組（P＜0.01）。

表6 2組大鼠表征比率的比較

4 討論

動(dòng)物模型是中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的橋梁和重要載體，在中醫(yī)理論研究以及中藥新藥研究中，迫切需要能夠達(dá)到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)又能充分體現(xiàn)中醫(yī)辨證論治理論特點(diǎn)的新型動(dòng)物模型，目前此項(xiàng)研究工作尚處于起步階段。以往的研究報(bào)道中，關(guān)于動(dòng)物表征采集方面的內(nèi)容報(bào)道較少，尤其是連續(xù)、全面地對(duì)不同疾病階段動(dòng)物的表征進(jìn)行采集的研究更為鮮見。本課題組拓展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表征觀察項(xiàng)目并進(jìn)一步完善觀察方法，制訂出一套較為系統(tǒng)和全面的觀察量表。依據(jù)臨床病證結(jié)合條件下的證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，按照相同或相似病理生理意義的原則，在動(dòng)物模型將表征進(jìn)行等效病理生理意義的轉(zhuǎn)化，以動(dòng)物表征作為部分臨床四診信息的替代，然后根據(jù)中醫(yī)臨床證候診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)模型動(dòng)物的證型進(jìn)行初步判定。

本研究結(jié)果提示，模型動(dòng)物從2次 STZ注射2周后至 2次 STZ注射后 10周觀察結(jié)束，F(xiàn)BG、TG、TC、AUG值均明顯高于正常組水平；FIN值先升高后與正常組水平相似，同時(shí)出現(xiàn)模型動(dòng)物體質(zhì)量降低、尿量增加、24h進(jìn)食量和飲水量增加。由此認(rèn)為，本研究中2型糖尿病大鼠模型復(fù)制成功。在2次STZ注射后1～4周，與正常組相比，活動(dòng)次數(shù)增加，背溫升高，各自爬臥，舌色鮮紅、舌干少津、爪干燥或脫屑比率均明顯升高，且多飲、多食、多尿、體質(zhì)量降低。根據(jù)《中醫(yī)診斷學(xué)》中對(duì)于消渴陰虛內(nèi)熱證咽干口燥、心煩畏熱、渴喜冷飲、多食易饑、溲赤便秘、舌紅苔黃的描述，認(rèn)為在2次 STZ注射后1～4周，模型大鼠與陰虛內(nèi)熱證的表現(xiàn)基本相符，故判定為陰虛內(nèi)熱證型。在2次注射 STZ后6～10周，與正常組相比，模型大鼠的活動(dòng)次數(shù)減少、毛潮濕、舌色鮮紅、舌干少津比率均明顯升高，且多飲、多食、多尿、體質(zhì)量降低。根據(jù)《中醫(yī)診斷學(xué)》中對(duì)于消渴氣陰兩虛證咽干口燥、倦怠乏力、氣短懶言、多食易饑、口渴喜飲、溲赤便秘、舌紅少津的描述，認(rèn)為在2次注射STZ后6～10周，模型大鼠與氣陰兩虛證的表現(xiàn)基本相符，故判定為氣陰兩虛證型。

由本研究結(jié)果可見，模型動(dòng)物在同一疾病的不同階段其表征特點(diǎn)確有變化，并出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此，對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)的多個(gè)表征進(jìn)行匯總分析，將使對(duì)疾病模型動(dòng)物進(jìn)行中醫(yī)證型的判定成為可能。由本研究結(jié)果可見，在動(dòng)物疾病模型中同樣存在著證型的階段性，即每種證型都具有一定的持續(xù)時(shí)間（時(shí)間窗），如陰虛內(nèi)熱證在2次 STZ注射后1～4周出現(xiàn)，而氣陰兩虛證在2次STZ注射后6～10周出現(xiàn)。

病證結(jié)合動(dòng)物模型的創(chuàng)建是中藥新藥對(duì)證治療評(píng)價(jià)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。建立病證結(jié)合動(dòng)物模型日益受到關(guān)注并逐漸成為中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型發(fā)展的新方向［5］。在疾病模型基礎(chǔ)上，動(dòng)態(tài)觀察模型動(dòng)物的宏觀表征和微觀指標(biāo)，綜合結(jié)果進(jìn)行證候判定，在此思路上構(gòu)建的病證結(jié)合動(dòng)物模型，具有客觀性強(qiáng)、可信度高以及更貼近臨床等特點(diǎn)，是證候動(dòng)物模型發(fā)展的必然趨勢(shì)［6］。本課題組在高脂飼料合并注射 STZ所致的2型糖尿病大鼠模型中觀察到不同疾病階段的表征變化特點(diǎn)，用中醫(yī)診斷學(xué)的方法分別判定為陰虛內(nèi)熱證和氣陰兩虛證，并初步確定了2種證型的時(shí)間窗。在下一步的研究中，本課題組將采用糖尿病陰虛內(nèi)熱證和氣陰兩虛證的代表性方劑對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行方劑反證，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究所判定的動(dòng)物證型的準(zhǔn)確性，旨在探討并創(chuàng)建2型糖尿病病證結(jié)合動(dòng)物模型研究的規(guī)律和方法。

［1］郭學(xué)軍，鄒移海，吳 凌，等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo) SD和 Wistar大鼠糖尿病模型的影響因素［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，16（4）：4-7.

［2］Ming Zhang，Xiao-Yan Lv，Jing Li，et al. The Characterization of High-Fat Diet and Multiple Low-Dose Streptozocin Induced Type 2 Diabetes Rat Model［J］. Experimental Diabetes Research，2008，704045：1-9.

［3］周迎生，高 妍，李 斌，等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13（3）：154-158.

［4］朱文鋒.中醫(yī)診斷學(xué)［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1995：149-153.

［5］許穎智，張軍平.病證結(jié)合在中醫(yī)辨證論治中的地位［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（11）：2362.

［6］劉 濤，王 偉.證候動(dòng)物模型研究的思索［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21（9）：550-551.