染色體3p區抑癌基因在非小細胞肺癌中的甲基化狀況與臨床意義

宋海珠 易俊 張有為 王銳 陳龍邦

DNA甲基化是表觀遺傳學的一種調控機制，抑癌基因啟動子區域CpG島的異常高甲基化，使染色質螺旋程度增加，基因轉錄受到抑制，與腫瘤發生密切相關[1]。肺癌，以非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）為主，是世界范圍內癌癥致死的首要原因。研究NSCLC特異的DNA甲基化將為揭示其發病機制提供線索并可能作為潛在的生物標記。

染色體3p區等位基因缺失是肺癌發生中較頻繁和早期的事件之一，其中3p12-13、3p14.2、3p21.1-21.2、3p21.3和3p24-26等被證實是缺失的熱點區域，提示在這些區域存在多個抑癌基因[2,3]。本實驗以改良的甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation specific PCR, MSP）檢測78例NSCLC組織中3p區抑癌基因DLEC1（deleted in lung and esophageal cancer 1）、RASSF1A（Ras associated domain family member 1）、hMLH1 （mutL homolog 1）、RARβ（retinoic acid receptor β）和FHIT（fragile histidine triad gene）的甲基化狀況，并分析與臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 標本 78例NSCLC組織標本（癌組織及癌旁＞5 cm處或切緣處正常組織）源自2007年11月-2008年7月于南京軍區南京總醫院心胸外科行手術治療者。所有患者均經病理檢查確診，術前未行放射治療或化學治療，其中男58例，女20例，年齡35歲-80歲，中位年齡59歲。根據國際抗癌聯盟（Universal Integrated Circuit Card, UICC）第7版指南進行分期，其中I期25例，II期33例，III期19例，IV期1例（腦轉移）。

1.2 DNA提取 采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒（德國Qiagen公司）提取組織DNA。操作嚴格依照說明書進行。

1.3 亞硫酸氫鹽修飾 采用EZ DNA Methylation-GOLD Kit（D5006）試劑盒（美國Zymo Research）。組織DNA經分光光度計測定濃度后取1 μg進行修飾。最后以10 μL M-Elution Buffer洗脫DNA，-80oC保存。經此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U）。

1.4 采用MSP法檢測基因啟動子區甲基化狀況 各引物序列及反應條件見表1。PCR反應體系25 μL，其中10×PCR buffer 2.5 μL （含Mg2+，終濃度為1.5 mmol/L），dNTP mixture 2.5 μL（終濃度250 μmol/L），上下游引物各2 μL（30 pmol），修飾后的DNA模板5 μL，滅菌去離子水10.85 μL，Taq酶0.15 μL（日本Takara公司）。正常人外周血淋巴細胞DNA作為非甲基化陽性對照，過量CpG（SssI）甲基化酶（美國New England Biolabs 公司）修飾的淋巴細胞DNA作為甲基化陽性對照，ddH2O代替DNA作為陰性對照。

1.5 采用RT-PCR檢測DLEC1基因的表達 采用Trizole一步法進行組織RNA的抽提，3 μL RNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。RNA定量后取2 μg進行逆轉錄反應（first strand cDNA kit, Takara），之后以25 μL反應體系進行體外PCR擴增。DLEC1及DAPDH引物見表1。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，在圖像掃描儀下觀察，用SmartView生物電泳圖像分析系統處理，并用同一樣品的GAPDH擴增產物作為內參照進行校正，得出目的條帶與內參照條帶的吸光度比值。

1.6 免疫組織化學法檢測DLEC1基因的表達 石蠟包埋切片經脫蠟、水化、抗原修復后，EnVision二步法檢測DLEC1蛋白表達，兔抗人DLEC1單抗（Sigma公司，1:200稀釋）4 °C孵育過夜，PBS沖洗，二抗（Dako, Ely, UK）室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染。實驗同時以PBS代替一抗作空白對照。DLEC1蛋白表達定位于細胞漿，為黃-棕黃色顆粒，采用半定量積分法判定結果。于高倍鏡下隨機選取5個視野（每個視野觀察細胞數不少于200個），具體標準如下：（1）陽性細胞數0-5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，＞50%為3分；（2）陽性強度無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將（1）（2）兩者積分相加，癌組織總分低于相應正常組織者為低表達。

1.7 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，結果以Mean±SD或百分比表示。DLEC1表達差異采用配對t檢驗；率的比較采取χ2檢驗或Fisher確切概率法；甲基化指數（methylation index, MI)，定義為每個樣本發生甲基化的位點與檢測的總位點的比值，組間差異比較行方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織甲基化狀況 DLEC1、RASSF1A、RARβ和hMLH1在78例NSCLC腫瘤組織中的甲基化頻率分別為41.03%、39.74%、30.77%和16.67%，而在相應正常組織中為3.85%、7.69%、8.97%和5.13%，差異均具有統計學意義（表2）。聯合檢測這4個基因甲基化在腫瘤組織中的陽性率達到69.23%，正常組織中為16.67%（P＜0.001）。FHIT基因在所檢測的40例樣本中，無論癌組織還是正常組織均無甲基化。典型MSP結果見圖1。

2.2 DNA甲基化與臨床病理特征的相關性 DLEC1基因甲基化與NSCLC臨床分期（I/II vs III/IV: 19/58 vs 13/20；P=0.011）和淋巴結轉移（N0 vs N1/N2/N3: 13/54 vs 19/34；P=0.019）有關，在不同年齡、性別、分化程度、腫瘤大小和是否吸煙的患者之間，DLEC1啟動子異常甲基化檢出率無差異。而RASSF1A、RARβ、hMLH1基因甲基化以及平均甲基化指數與臨床病理特征無關聯（表3）。

表1 引物序列Tab 1 List of primer sequences

表2 非小細胞肺癌組織和相應正常組織甲基化差異 (n=78)Tab 2 Methylation profiles in NSCLC tissues and matched normal tissues (n=78)

圖1 MSP法檢測腫瘤組織和正常組織甲基化的結果（病例11-13）。 T：腫瘤組織；N：正常組織；M：甲基化；U：未甲基化；Pos：陽性對照；Neg：陰性對照。Fig 1 Representative MSP profiles in matched NSCLC and adjacent normal lung tissues (cases 11-13). T: tumor tissues； N: normal tissues；M: methylation； U: unmethylation； Pos: positive control； Neg: negtive control.

2.3 DLEC1基因表達狀況 新型抑癌基因DLEC1在78例NSCLC組織中的表達通過RT-PCR（圖2）和免疫組化（圖3）鑒定。與相應正常組織相比，44例（56.41%）腫瘤組織的DLEC1基因在mRNA和蛋白水平均表達下調或缺失；并且，在32例甲基化的腫瘤組織中，28例表現出DLEC1下調或缺失，表明DLEC1基因失活與啟動子高甲基化密切相關（表4，P＜0.001）。

3 討論

圖2 DLEC1在非小細胞肺癌中的mRNA表達。A：典型PCR電泳結果（病例11-13）；B：腫瘤組織中DLEC1平均吸光度比值低于相應正常組織。*P＜0.001。Fig 2 mRNA expression levels of DLEC1 in NSCLC tissues determined by RT-PCR.A: Typical gel electrophoresis results in three matched pairs (cases 11-13) of tumor(T) and their adjacent normal lung tissues (N)； B: Histogram of the relative mRNA expression level of DLEC1 in NSCLC and their adjacent normal tissues. *P＜0.001.

圖3 DLEC1在非小細胞肺癌中的蛋白表達（病例12，EnVision法，×200）。A：腺癌組織呈陰性表達；B：正常肺組織陽性表達。Fig 3 Protein expression levels of DLEC1 in NSCLC determined by immunohistochemical staining (case 12, EnVision, ×100). DLEC1 protein was silenced in adenocarcinoma tissues (A), while widely expressed in adjacent normal lung tissues (B).

NSCLC的發生是多步驟的過程，涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。除了基因水平上的突變、缺失等，表觀遺傳學的改變，特別是DNA的5'CpG島區域異常甲基化是導致抑癌基因失活的主要原因之一。由于表觀遺傳學的改變常發生于遺傳學改變之前，因此在NSCLC發生的早期就可能檢測到抑癌基因異常甲基化[4]，這對于腫瘤的早期診斷具有重要意義。

3號染色體短臂（3p）被認為是多個抑癌基因“停泊”的港口，本研究在78例NSCLC組織中檢測5個典型的3p區抑癌基因甲基化情況，包括位于3p21.3-22的DLEC1，3p21.3的RASSF1A、hMLH1，3p24的RARβ和3p14.2的FHIT。結果發現，DLEC1、RASSF1A、RARβ和hMLH1在癌組織的甲基化頻率依次為41.03%、39.74%、30.77%和16.67%，均顯著高于相應正常組織。并且，69.23%的腫瘤組織至少發生這四者之中一個位點的甲基化，而正常組織僅為16.67%。其中，DLEC1是新近在肺癌、食管癌和腎癌中鑒定的候選抑癌基因，轉染DCEC1基因到腫瘤細胞株中明顯抑制細胞克隆形成及體內致瘤性[5,6]，但其抑癌作用的機制尚不明確；RASSF1A是Ras激活信號傳導通路的負向調節因子，可阻斷Ras生長效應信號由胞外傳向胞內[7]；RARβ是維甲酸（retinoic acid, RA）受體，參與抑制維甲酸介導的細胞增殖和分化[8]；hMLH1屬于錯配修復基因，對維護基因組的穩定性起著重要的作用[9]。它們在NSCLC中的異常甲基化均有報道，本實驗進一步證實其在中國人群中的普遍性，可能是NSCLC發病的重要機制。

值得注意的是，FHIT基因參與DNA修復及細胞凋亡抑制，在NSCLC中的表達下調及啟動子高甲基化亦有諸多報道[8,10]，但在本實驗檢測的40例樣本中，FHIT在癌組織和正常組織均無異常甲基化。這可能與樣本異質性有關，除甲基化之外，尚有其它因素如微衛星不穩定（microsatellite instability, MSI）和雜合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）等導致FHIT基因失活[11]。

進一步的分析表明，DLEC1基因甲基化與NSCLC臨床分期和淋巴結轉移相關，提示DLEC1啟動子甲基化還參與腫瘤演進，可能作為潛在的預后指標。但RASSF1A、RARβ、hMLH1基因甲基化以及包括DLEC1在內的四者平均MI與NSCLC臨床病理特征無關聯，表明3p區抑癌基因甲基化是一個相對獨立的危險因素，在總體水平上仍是NSCLC發生中的早期事件，可作為NSCLC早期診斷的潛在標記物。

新型抑癌基因DLEC1包含37個外顯子，長約59 kb，編碼一個含有1,755個氨基酸的蛋白，這個蛋白與已知的所有蛋白都沒有相近的同源序列[5]，其在人類正常組織中廣泛表達，而在大多數腫瘤組織和細胞系中表達下調。目前的研究[6,12-15]表明啟動子高甲基化可能是導致DLEC1基因失活的重要原因，如DLEC1在大部分肝癌細胞系和70.6%（48/68）的原發肝癌中表現出高甲基化，而在臨近正常肝組織中僅為10.3%（7/68），去甲基化藥物5-Aza-dC處理可使肝癌細胞系恢復DLEC1表達[6]；鼻咽癌中，71%（30/42）的原發腫瘤檢出DLEC1高甲基化，且所有DLEC1表達沉默的腫瘤細胞系均為高甲基化，而DLEC1充分表達的鼻咽部上皮細胞均為未甲基化[13]。在肺癌組織中，Seng等[16]也發現，38.9%（93/239）的

NSCLC中存在DLEC1高甲基化，并與患者臨床分期、淋巴結轉移和不良預后有關。本研究進一步證實，56.41%（44/78）的NSCLC組織中，DLEC1基因在mRNA和蛋白水平均表達下調或缺失，并且，DLEC1基因失活與啟動子高甲基化密切相關，有助于進一步揭示其在NSCLC發生發展中的作用。

表3 3p區抑癌基因甲基化與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系Tab 3 Association between the DNA methylation in NSCLC specimens and clinicopathological features

表4 DLEC1基因在非小細胞肺癌中的表達與啟動子甲基化的關系Tab 4 DLEC1 downregulation in NSCLC tissues was associated with promoter methylation

總之，本研究證實3p區抑癌基因甲基化是NSCLC發生中的重要分子事件，新型抑癌基因DLEC1基因失活與啟動子高甲基化有關。