非小細(xì)胞肺癌患者h(yuǎn)OGG1基因啟動(dòng)子區(qū)域突變的研究

劉霞 趙軍 劉仍允 雷哲 尤嘉琮 周清華 張洪濤

正常的氧化代謝和環(huán)境壓力都可以對(duì)持續(xù)暴露其中的細(xì)胞DNA造成損傷，從而影響基因組的穩(wěn)定性。生物演化出不同的DNA修復(fù)途徑對(duì)不同的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，其中最主要的途徑就是通過特定的DNA糖基化酶對(duì)錯(cuò)配堿基進(jìn)行識(shí)別和切除修復(fù)。8-羥基鳥嘌呤（8-dihydro-8-oxoguanine, 8-OH-G）是一種主要的DNA氧化損傷，此種異常堿基不能阻止DNA鏈延伸，在復(fù)制時(shí)由于空間構(gòu)象改變使該堿基優(yōu)先與腺嘌呤配對(duì)，可導(dǎo)致G:C→T:A顛換突變[1]，若不及時(shí)修復(fù)可導(dǎo)致DNA突變的積累。因此，該突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、機(jī)體細(xì)胞的老化及某些退行性疾病均有密切關(guān)系[2-4]。體內(nèi)特異識(shí)別8-OH-G并將其切除修復(fù)的酶被稱為8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（8-hydroxygumine DNA glycosylase, OGG1），通常稱人類OGG1為hOGG1。該基因位于人染色體3p26.2，起始密碼子ATG位于第1外顯子中。根據(jù)對(duì)第7和第8外顯子的不同選擇，hOGG1基因可以選擇性拼接產(chǎn)生兩大類hOGG1蛋白，α型和β型[2]。α-hOGG1蛋白含345個(gè)氨基酸，分子量為39 kDa，有核定位信號(hào)；β-hOGG1蛋白含424個(gè)氨基酸，分子量為47 kDa，定位于線粒體。

由于許多內(nèi)源性和外源性致癌物可產(chǎn)生8-OH-G，所以修復(fù)8-OH-G的能力與個(gè)體對(duì)致癌物作用的敏感性密切相關(guān)。無(wú)論hOGG1基因突變或缺失，都可能使細(xì)胞修復(fù)8-OH-G的能力降低或喪失，從而使此種個(gè)體罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增高。關(guān)于hOGG1基因的突變和多態(tài)性與DNA氧化損傷修復(fù)能力及腫瘤易感性的關(guān)系已經(jīng)引起一些研究者的關(guān)注[5-7]。本研究采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism, SSCP）分析檢測(cè)部分非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者癌組織和癌旁正常組織中hOGG1基因的啟動(dòng)子區(qū)域的突變，研究其與NSCLC發(fā)生、發(fā)展、分化及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 原發(fā)性NSCLC 40例，為蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2003年1月-2005年12月新鮮手術(shù)切除標(biāo)本，男28例，女12例，年齡37歲-79歲，中位年齡60歲。患者術(shù)前均未接受放、化療。腫瘤組織均取自腫瘤中心非壞死部位，癌旁組織取自腫瘤旁約5 cm正常肺組織，組織標(biāo)本切除后30 min內(nèi)入液氮凍存。所有病例均有病理學(xué)診斷，其中腺癌16例，鱗癌15例，腺鱗癌1例，大細(xì)胞癌6例，不典型類癌2例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。I期14例，II期18例，III期7例，IV期1例。

1.2 DNA的抽提 酚-氯仿抽提法抽提DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增 由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系25 μL，94oC預(yù)變性5 min，94oC變性45 s，退火溫度30 s，72oC延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72oC后延伸10 min。PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色紫外凝膠成像分析系統(tǒng)拍照鑒定。

1.4 SSCP分析 SSCP條件見表1，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度和電泳時(shí)間根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度及電泳條帶結(jié)果進(jìn)行調(diào)節(jié)。取10 μL PCR產(chǎn)物，加入10 μL變性劑（95%甲酰胺，0.05%溴酚藍(lán)，0.05%二甲苯青，1×TBE），煮沸5 min，取出立刻放入冰浴中2 min以上，全部上樣，8oC，20 W恒功率電泳5 h左右，取下凝膠，將其浸在含0.5 μg/mL溴化錠的1×TBE緩沖液中染色10 min-15 min，在紫外凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行小樣本Fisher確切概率分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 hOGG1啟動(dòng)子區(qū)域的SSCP和DNA測(cè)序分析 40例NSCLC患者樣本中只有第2號(hào)引物和第11號(hào)引物出現(xiàn)癌和癌旁對(duì)應(yīng)一致的異常條帶。2號(hào)引物有9例樣本出現(xiàn)3帶型（圖1），經(jīng)測(cè)序表明是單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism, SNP）-1096T/C（rs159153）；11號(hào)引物產(chǎn)物出現(xiàn)1例4帶型和2例3帶型兩種電泳條帶（圖2），測(cè)序結(jié)果表明為位于第一外顯子的5'UTR區(qū)的SNP位點(diǎn)-23A/G（rs1801129）和-18G/T（rs1801126）。

2.2 NSCLC患者中rs159153多態(tài)基因型與臨床病理特征的關(guān)系 hOGG1啟動(dòng)子區(qū)域-1096 bp T/C多態(tài)（rs159153），該位點(diǎn)雜合子在中國(guó)人群中的報(bào)道頻率為22.2%（www.HapMap.org），與本研究所測(cè)得頻率22.5%無(wú)差異，不能說明該位點(diǎn)與NSCLC的發(fā)生有關(guān)，但對(duì)臨床資料用Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示該位點(diǎn)與TNM分期情況相關(guān)，32例I期+II期患者中有4例雜合子，8例III期+IV期患者中有5例雜合子（P=0.008），顯示該多態(tài)與腫瘤的進(jìn)程正相關(guān)，而與性別、年齡、組織學(xué)類型、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其它均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。SNP位點(diǎn)-23A/G（rs1801129）沒有報(bào)道頻率，本研究的頻率為2.5%。SNP位點(diǎn)-18G/T（rs1801126）在中國(guó)人群中的報(bào)道頻率為4.8%，與本研究所得頻率5%沒有差異，Ishida等[8]曾報(bào)道日本人的該位點(diǎn)與肺腺癌明顯相關(guān)（OR=3.15, P=0.014），而與肺鱗癌無(wú)明顯相關(guān)（OR=0.86, P＞0.05），由于樣本量較少，本研究未做此具體分析。

表1 hOGG1啟動(dòng)子區(qū)PCR引物及SSCP條件Tab 1 PCR primers used for the promoter of hOGG1 and SSCP conditions

圖1 hOGG1第2對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP和DNA測(cè)序。A：SSCP分析顯示：8、9、11、16號(hào)樣本呈三條帶，其余為兩條帶；B：兩條帶PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示在-2096 bp處的基因型為T/T，三條帶為T/C。Fig 1 SSCP analysis and DNA sequencing for PCR product amplified by No.2 pair of primers. A: SSCP analysis shows an altered pattern with three bands in samples 8, 9, 11 and 16, and a normal pattern with two bands in other samples； B: DNA sequencing reveals that samples with three bands have T/C allele and those with two bands have T/T allele at the site -2096 bp.

2.3 NSCLC患者中臨床病理特征與吸煙史的關(guān)系 本研究對(duì)這40例NSCLC患者的吸煙史調(diào)查表明，吸煙與NSCLC病理分型有關(guān)，11例有吸煙史的患者中只有1例是腺癌（P=0.027），這與以往的報(bào)道結(jié)果一致[9]。此外，吸煙史與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況也有關(guān)，21例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中有9例吸煙，19例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中只有2例吸煙（P=0.034）(表3）。

圖2 hOGG1第11對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP和DNA測(cè)序。A：SSCP分析顯示：6、14號(hào)樣本呈三條帶，15號(hào)四條帶，其余為兩條帶；B：兩條帶PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示在-18 bp處的基因型為G/G，三條帶為G/T；兩條帶PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示在-23 bp處的基因型為A/A，四條帶為A/G。Fig 2 SSCP analysis and DNA sequencing for PCR product amplified by No.11 pair of primers. A: SSCP analysis shows altered patterns with three bands in samples 6, 14 and four bands in sample 15, and a normal pattern with two bands in other samples； B: DNA sequencing reveals that samples with three bands have G/T allele and those with two bands have G/G allele at the site -18 bp, and the sample with four bands have A/G allele and those with two bands have A/A allele at the site -23 bp.

表2 40例NSCLC患者中rs159153多態(tài)基因型與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Associations between SNP rs159153 and clinical characteristics in 40 NSCLCs

表3 40例NSCLC患者中臨床病理特征與吸煙史的關(guān)系Tab 3 Associations between clinical characteristics and smoking history in 40 NSCLCs

3 討論

肺癌發(fā)病率、死亡率近年來呈上升趨勢(shì)，80%的臨床肺癌都是NSCLC。其病理分型分期直接與其診治和預(yù)后相關(guān)，爭(zhēng)取早期診斷在目前是治療肺癌的關(guān)鍵，利用分子生物學(xué)手段對(duì)癌前病變或組織形態(tài)學(xué)仍處于正常時(shí)期的病例進(jìn)行早期檢測(cè)已成為一大熱點(diǎn)。作為DNA切除修復(fù)酶基因，hOGG1在腫瘤發(fā)生中的作用已經(jīng)有許多報(bào)道[10-12]。該基因與肺癌的關(guān)系已引起密切關(guān)注[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)首次研究了該基因啟動(dòng)子區(qū)域的突變與NSCLC的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)rs159153與NSCLC的TNM分期相關(guān)，該位點(diǎn)雜合的患者腫瘤進(jìn)展較快，預(yù)示著不良的預(yù)后。這一位點(diǎn)與腫瘤等疾病的相關(guān)性在國(guó)內(nèi)外均未曾報(bào)道。由于該位點(diǎn)位于hOGG1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，我們猜測(cè)其可能對(duì)該基因的表達(dá)效率有所影響。已有研究[12]發(fā)現(xiàn)hOGG1基因表達(dá)量的下降會(huì)影響DNA的修復(fù)，可能與部分肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。hOGG1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化、基因位點(diǎn)的雜合性缺失、基因突變及染色體的畸變等都可能是其表達(dá)量下降的原因。除了表達(dá)水平上的調(diào)節(jié)，其外顯子的多態(tài)和選擇性拼接可以形成多種類型的hOGG1蛋白，不同類型的蛋白對(duì)DNA修復(fù)能力也有所不同，其中第326位密碼子C/G多態(tài)產(chǎn)生hOGG1-Ser326和hOGG1-Cys326兩種蛋白，前者對(duì)DNA的修復(fù)能力比后者強(qiáng)，目前對(duì)該基因多態(tài)的研究多集中于此位點(diǎn)[1,7,10,14,15]。此外，hOGG1蛋白對(duì)氧化產(chǎn)物的識(shí)別能力可能也影響其在細(xì)胞中的定位，從而影響對(duì)DNA損傷的修復(fù)。最近Campalans等[16]研究發(fā)現(xiàn)，人細(xì)胞中的hOGG1蛋白原本定位于可溶性核質(zhì)中，UVA照射后開始重新分布到核基質(zhì)。可以觀察到hOGG1蛋白集中定位在核骨架和細(xì)胞器官上，散布在與轉(zhuǎn)錄和RNA剪接相關(guān)的染色質(zhì)區(qū)域。突變hOGG1蛋白不能與底物結(jié)合，顯示hOGG1蛋白的重新定位不依賴于酶對(duì)DNA損傷的識(shí)別。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，UVA照射后hOGG1蛋白到核骨架的補(bǔ)充可以被抗氧化劑阻斷，提示反應(yīng)性氧化產(chǎn)物是hOGG1蛋白重新分布的信號(hào)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)吸煙者所致的NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)程明顯較慢，而SNP位點(diǎn)rs159153雜合的患者卻明顯進(jìn)程較快，顯示遺傳因素在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中起著不可忽視的作用。可能其基因本身的缺陷使得DNA氧化損傷難以修復(fù)，而導(dǎo)致的突變?nèi)绻l(fā)生在呼吸鏈相關(guān)基因，則可能會(huì)加劇DNA氧化損傷的發(fā)生。也可能煙草所含的致癌物主要是通過其它途徑影響腫瘤的發(fā)生，我們的結(jié)果也顯示吸煙與NSCLC的病理分型明顯相關(guān)，而該位點(diǎn)多態(tài)與NSCLC的病理分型無(wú)關(guān)。

總之，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多基因參與的過程，單個(gè)基因改變不足以解釋腫瘤發(fā)生的機(jī)制，許多腫瘤抑制基因都與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]。目前我們只是初步研究了該基因啟動(dòng)子區(qū)域的SNP位點(diǎn)rs159153與NSCLC的關(guān)系，該位點(diǎn)如何參與hOGG1基因表達(dá)的調(diào)控，與DNA上其它功能性位點(diǎn)之間的相互作用機(jī)制及其對(duì)hOGG1蛋白活性的影響還有待我們進(jìn)一步深入研究。