RKIP在肺鱗癌組織中的表達(dá)及其意義

徐海源 王馨 沈文香 王李強(qiáng) 沈剛 陳敏斌 周麗娜

Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein, RKIP）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine binding protein, PEBP）家族的成員，因發(fā)現(xiàn)PEBP能特異性地抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路而將其命名為RKIP[1]。不同種屬的PEBP家族成員都具有相似的結(jié)構(gòu)域：即由一個大的β-折疊與連接在兩側(cè)的較小的β-折疊和兩個C端α-螺旋組成。在該結(jié)構(gòu)中存在一個高度保守的磷酸鹽結(jié)合袋，對PEBP的功能非常重要[1]。人類RKIP基因定位于染色體12q24.23，其mRNA長1,507 bp，由4個外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。RKIP在哺乳動物的腦、心、肝、肺及睪丸組織中含量豐富，參與質(zhì)膜生物合成、神經(jīng)發(fā)育、精子發(fā)生、細(xì)胞凋亡等生理病理過程。近年來研究[2,3]顯示，RKIP不僅可以干擾Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路，而且還可以抑制NF-κB和G蛋白偶聯(lián)受體激酶等信號傳導(dǎo)過程，從而廢除細(xì)胞的生存和抗凋亡特性。2003年Fu等[4]研究發(fā)現(xiàn)PKIP可以抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用后，PKIP成為腫瘤領(lǐng)域的一個新的熱點(diǎn)。最近研究資料[4-8]還顯示RKIP的表達(dá)減弱或丟失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，在前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌以及相關(guān)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)均低于其在正常對照組中的表達(dá)。但有關(guān)RKIP是否在肺鱗癌中表達(dá)以及與肺鱗癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究仍未見相關(guān)報道。我國是世界上肺癌患者最多的國家，且發(fā)病率和病死率一直呈上升趨勢。近年來，盡管在肺癌治療方面有了很大的進(jìn)展，但肺癌生存率仍然不容樂觀[9]。其主要原因是肺癌生物學(xué)特性十分復(fù)雜，惡性程度高，且80%肺癌為肺鱗癌，此類患者在確診時已屬晚期，大部分患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后甚差。為此，我們必須尋找更加精確、有效的分子標(biāo)志物，以期早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。本研究通過RT-PCR和Western blot方法檢測肺鱗癌組織及其癌旁正常組織中RKIP的表達(dá)差異，探討RKIP與肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展以及侵潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期為肺癌的預(yù)后判斷以及靶向治療等提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院和廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院2007年6月-2010年6月收治的肺鱗癌患者手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本56例，每例標(biāo)本取材癌組織及其鄰近的正常組織，立即置液氮中保存?zhèn)溆谩Ｆ渲心行?2例，女性24例，年齡26歲-75歲，平均56歲，其中＜60歲者36例，≥60歲者20例。術(shù)前未經(jīng)任何治療，病理學(xué)診斷56例肺鱗癌均為鱗癌。分化程度：高分化17例，中分化21例，低分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；腫瘤原發(fā)灶＜3 cm者23例，≥3 cm者33例。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒（INVITROGEN公司），RTPCR試劑盒（GIBCOBRL公司），RIPA裂解液［1%NP-40,1%Deoxycholate, 0.1%SDS, 500 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF, 19 Protease Inhibitor Cocktail (Roche,New Jersey, USA)］，TBST（10 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1%Tween-20），RKIP（NM_002567.2）上游引物：5'-AAGAATAGACCCACCAGCAT-3'，下游引物：5'-AACCAGCCAGACATAGCG-3'，預(yù)計擴(kuò)增片段長度為234 bp；GAPDH（NG_007073.2）上游引物：5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，下游引物：5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'，預(yù)計擴(kuò)增片段長度為382 bp。所有引物序列均由上海英俊生物工程有限公司提供。RKIP一抗為兔抗人多克隆抗體（Invitroge公司，美國），二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體（Abcam公司，英國），內(nèi)參為單克隆小鼠抗人GAPDH抗體（Abcam公司，英國），二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體（Abbiotec公司，美國），ECL發(fā)光液（Pierce公司，美國），BCA蛋白濃度測定試劑盒為國產(chǎn)碧云天產(chǎn)品。

1.3 采用RT-PCR檢測RKIP mRNA的表達(dá)變化 按照試劑盒的操作說明提取癌組織和癌旁組織總RNA，取50 mg組織，加入1 mL Trizol試劑，勻漿，然后加入0.2 mL氯仿，振蕩20 s，靜置3 min。12,000 rpm離心10 min，取上清；加入0.5 mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min。15,000 rpm離心10 min，棄上清。加入1 mL的75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，離心，棄上清；然后晾干，加入20 μL的DEPC水溶解（65oC促溶10 min-15 min）。然后進(jìn)行RT反應(yīng)。在20 μL的反應(yīng)體積中加入2.0 μL總RNA，37oC孵育1 h，接著95oC滅活5 min，再立即冰浴，-20oC保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)而設(shè)計引物，接著進(jìn)行PCR反應(yīng)，在25 μL PCR反應(yīng)體系中加入cDNA 5 μL，擴(kuò)增條件為：94oC預(yù)變性3 min，94oC變性45 s，57oC退火45 s，72oC延伸45 s；循環(huán)30次。最后72oC延伸10 min，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4 Western blot檢測RKIP蛋白的表達(dá)變化 將液氮凍存的組織樣品研磨，然后用RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，16,000 g離心30 min，取上清，用BCA法測上清蛋白濃度，在每一個病例樣品中取10 μg混合作為肺鱗癌組織蛋白樣品，癌旁組織蛋白樣品也是由每一個癌旁蛋白樣品分別取10 μg混合而成。制備12%SDS-PAGE，每泳道加總蛋白量40 μg，進(jìn)行電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜（Amresco公司，美國），在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中常溫封閉1 h，然后分別加入RKIP兔抗人多克隆抗體（1:1,000稀釋）及GAPDH小鼠抗人單克隆抗體（1:1,000稀釋），4oC孵育過夜，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:2,000稀釋）和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體（1:2,000稀釋），37oC孵育1 h，TBST洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光試劑自顯影。RKIP相對含量用RKIP/GAPDH灰度比值表示，灰度采用QuantityOne軟件（Bio-Rad公司，美國）分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Stata 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肺鱗癌組織中RKIP mRNA表達(dá) RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測見一特異擴(kuò)增條帶，其分子量大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。RKIP mRNA在肺鱗癌組織中的表達(dá)情況見表1。即RKIP基因在肺鱗癌組織中表達(dá)陽性率明顯低于正常組織（P＜0.05），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），但與患者性別、年齡及腫瘤的大小及分化程度無關(guān)（P＞0.05）。

2.2 肺鱗癌組織及癌旁組織中RKIP蛋白的表達(dá) RKIP蛋白在肺鱗癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織（P=0.037,1）（圖2）。

3 討論

肺癌為當(dāng)前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病。近半個世紀(jì)以來，世界各國肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯的增高。全球每年新增肺癌病例將達(dá)120萬。我國是世界上肺癌患者最多的國家，且發(fā)病率和病死率一直呈上升趨勢。近30年來，盡管在肺癌治療方面有了很大的進(jìn)展，但肺癌生存率仍然不容樂觀[9]。其主要原因是肺癌生物學(xué)特性十分復(fù)雜，惡性程度高，且80%肺癌為肺鱗癌，此類患者在確診時已屬晚期，大部分患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后甚差。為此，我們必須尋找更加精確、有效的分子標(biāo)志物，以期早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。

圖1 肺鱗癌組織及癌旁組織中RKIP mRNA的表達(dá)。N：癌旁組織；C：肺鱗癌組織。Fig 1 The expression of RKIP mRNA in lung squamous cell carcinoma tissues and adjacent cancer tissues. N: adjacent normal tissues； C:squamous cell carcinoma tissues.

表1 肺鱗癌組織中RKIP mRNA表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Tab 1 The relation between expression of RKIP mRNA in lung squamous cell carcinoma tissues and clinicopathologic factors

圖2 肺鱗癌組織及癌旁組織中RKIP蛋白的表達(dá)。A：Western blot結(jié)果；B：RKIP蛋白在肺鱗癌組織及癌旁組織中的相對表達(dá)變化。*：癌旁組織與肺鱗癌組織相比，P＜0.05。Fig 2 The expression of RKIP in lung squamous cell carcinoma tissues and adjacent cancer tissues. A: Results of Western blot； B: The relative expression changes of RKIP in squamous cell carcinoma tissues and adjacent cancer tissues. *: adjacent cancer tissues vs squamous cell carcinoma tissues, P＜0.05.

RKIP是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，廣泛表達(dá)于哺乳動物的腦、心、肝、肺及睪丸等組織，參與質(zhì)膜生物合成、神經(jīng)發(fā)育、精子發(fā)生、細(xì)胞凋亡等生理病理過程。近年來研究[2,3]顯示，RKIP不僅可以干擾Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路，而且還可以抑制NF-κB和G蛋白偶聯(lián)受體激酶等信號傳導(dǎo)過程。自2003年Fu等[4]研究發(fā)現(xiàn)PKIP可以抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用后，PKIP成為腫瘤領(lǐng)域的一個新的熱點(diǎn)。Lee等[5,10]研究發(fā)現(xiàn)RKIP在肝癌中的表達(dá)明顯低于鄰近的正常肝組織，增加RKIP的表達(dá)可以減少肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。RKIP在甲狀腺癌中的表達(dá)低于正常的甲狀腺組織，外源性的RKIP可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的生長[11]。還有研究[8,12]發(fā)現(xiàn)PKIP在乳腺癌的原發(fā)病灶中高表達(dá)，其表達(dá)與乳腺癌的類型、分化程度、大小、ER的表達(dá)無關(guān)，但在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中低表達(dá)或無表達(dá)；RKIP在正常黑色素細(xì)胞中表達(dá)量最高，黑色素瘤次之，黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶最低或缺失；過表達(dá)RKIP可以抑制高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[6]。本研究通過檢測肺鱗癌組織及其癌旁正常組織中RKIP基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：RKIP mRNA在肺鱗癌組織中表達(dá)的陽性率明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），但與患者的性別、年齡、腫瘤的大小及分化程度無關(guān)（P＞0.05）；RKIP蛋白在肺鱗癌組織中表達(dá)也明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05）。可見RKIP在肺鱗癌組織中表達(dá)結(jié)果與其它腫瘤相似。

RKIP可破壞Raf-1和MEK-1形成的復(fù)合物，使Raf-1脫離MEK-1。RKIP可以分別與Raf-1和MEK-1結(jié)合，當(dāng)與其中任意一個結(jié)合時就足以抑制下游信號[13]，而在本研究中發(fā)現(xiàn)RKIP在肺鱗癌組織中明顯表達(dá)減弱或缺失，這就大大削減了RKIP對Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路的抑制作用，從而可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和發(fā)育，這可能與肺鱗癌的發(fā)生相關(guān)。另外，RKIP還可以通過與NF-κB激活途徑的4個激酶NIK （NF-κB inducing kinase）、TAKI（TGF-β activated kinase 1）、IKKα（IκB kinase α）和IKKβ（IκB kinaseβ）相互作用，從而抑制NF-κB激活，減弱細(xì)胞的抗凋亡特性[1]。RKIP在肺鱗癌組織中明顯表達(dá)減弱或缺失，可以促進(jìn)NF-κB通路的激活，增加細(xì)胞的抗凋亡性能，這可能與肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Beshir等[2]研究發(fā)現(xiàn)，RKIP可以控制基質(zhì)金屬蛋白酶1/2（MMP-1/2）的表達(dá)，從而發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵潤轉(zhuǎn)移的功能；沉默RKIP后腫瘤細(xì)胞的侵潤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，MMP-1/2表達(dá)水平增高；過表達(dá)RKIP后腫瘤細(xì)胞的侵潤轉(zhuǎn)移能力減弱，MMP-1/2表達(dá)水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)RKIP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中的表達(dá)陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）。RKIP在肺鱗癌組織中表達(dá)減弱或缺失，可能增加了MMP-1/2的表達(dá)，從而促進(jìn)了肺鱗癌細(xì)胞的侵潤轉(zhuǎn)移，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，RKIP的表達(dá)減弱或缺失在肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展以及侵潤轉(zhuǎn)移過程中可能起著重要的作用。這或許可以為肺鱗癌的治療提供一個潛在的靶標(biāo)。