HIF-1α、COX-2和E-cadherin在肺腺癌的表達及臨床意義

谷松濤 秦建文

實體腫瘤缺氧是一種普遍現象，腫瘤為適應低氧而發生一系列生物學改變，廣泛存在于大多數實體腫瘤中的低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）是這一系列改變的關鍵調控因子。腫瘤細胞通過高表達HIF-1α對其下游基因進行調控以適應低氧環境，促進腫瘤生長轉移。有臨床實驗[1]證明環氧化酶-2在多種惡性腫瘤中有高表達。近來在胃癌的研究[2]中發現環氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）受HIF-1α的調控，COX-2可能是HIF-1α下游目的基因，是腫瘤適應低氧的促進生存轉移的重要途徑，但尚缺乏肺腺癌的臨床報道。上皮型鈣粘附分子（E-cadherin）的缺失與肺腺癌侵襲轉移有關，多項研究提示肺腺癌組織E-cadherin表達下降，同時在卵巢癌的研究中[3]發現HIF-1α和E-cadherin表達水平高度相關，而在肺腺癌中E-cadherin的表達是否也同時受HIF-1α的調控目前尚未見明確的報道。本研究聯合檢測三者在肺腺癌中的表達情況，探討其與臨床病理因素的關系及其可能存在的內在聯系。

1 對象和方法

1.1 對象 45例肺腺癌來自天津市胸科醫院2006年9月-2007年10月胸外科住院患者手術切除標本。經病理明確證實，且不伴有其它疾病，術前均未行放化療。男性28例，女性17例，平均年齡62.8歲±6.8歲。臨床分期根據1997年第八屆國際肺癌大會公布的TNM分類標準，I期20例，II期10例，III期15例。淋巴結轉移陽性22例，陰性23例。高分化14例，中分化12例，低分化19例。正常對照組10例正常肺組織來自同期胸科醫院非腫瘤患者手術切除的正常肺組織，且經病理證實。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 HIF-1α鼠抗人單克隆抗體sc-53546，購于SANTA CRUZ公司。COX-2兔抗人單克隆抗體ZA-0515、E-cadherin鼠抗人單克隆抗體ZM-0092、二步法免疫組化檢測試劑盒（PV-9000）、DAB顯色試劑盒、APES防脫片膠工作液均購于北京中杉金橋試劑公司。

1.2.2 主要儀器 石蠟切片機（德國Leica公司）、Olympus光學顯微鏡、醫用微波爐。采用二步法免疫組化檢測，步驟按試劑盒說明書操作。

1.3 結果判定 隨機選擇5個高倍視野，計數1,000個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分率，HIF-1α和COX-2陽性細胞百分率≥10%為陽性表達，E-cadherin陽性細胞百分率≤70%為表達下降，＞70%為正常表達。HIF-1α蛋白染色陽性細胞標準為胞漿或胞核內可見棕黃色顆粒。COX-2蛋白染色陽性細胞標準為胞漿內出現棕黃色顆粒。E-cadherin蛋白染色陽性細胞標準為胞膜可見棕黃色顆粒。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包進行統計，免疫組化結果為計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05有統計學差異。

2 結果

2.1 HIF-1α的蛋白表達與臨床病理資料的關系 10例正常對照組均未見HIF-1α的表達。45例肺腺癌HIF-1α的陽性表達率為60%（27/45）。在肺腺癌組不同性別、年齡之間HIF-1α的表達無統計學差異（χ2=1.28, P＞0.05；χ2=0.13, P＞0.05）。HIF-1α的蛋白表達與患者是否吸煙無關（χ2=1.5, P＞0.05）。淋巴結轉移陽性組HIF-1α的陽性表達率（68.2%）與淋巴結轉移陰性組（52.2%）相比差異無統計學意義（χ2=1.2, P＞0.05）。HIF-1α陽性表達與肺腺癌的分化程度、術后分期無關（χ2=2.92, P＞0.05； χ2=3.4,P＞0.05）。腫瘤最大直徑＞2 cm組HIF-1α的陽性表達率（69.7%）明顯高于≤2 cm組（33.3%），差異有統計學意義（χ2=4.85, P＜0.05）（表1，圖1）。

2.2 COX-2的蛋白表達與臨床病理資料的關系 10例正常對照組均未見COX-2的表達。45例肺腺癌COX-2的陽性表達率為40%（18/45）。不同性別、年齡組之間COX-2的表達無差異（χ2=0.57, P＞0.05； χ2=0.95, P＞0.05）。COX-2的蛋白表達與患者是否吸煙無關（χ2=1.5, P＞0.05）。COX-2表達在不同分化程度組之間無差異（χ2=0.16, P＞0.05）。淋巴結轉移陽性組COX-2的陽性表達率（63.7%）與淋巴結轉移陰性組（17.3%）相比差異有統計學意義（χ2=10.0,P＜0.01）。腫瘤最大直徑＞2 cm組COX-2的陽性表達率（51.5%）明顯高于≤2 cm組（8.3%），差異有統計學意義（χ2=6.84, P＜0.01）。COX-2陽性表達率在術后分期I期組為15%明顯低于II期和III期組（60%），具有明顯的統計學差異（χ2=9.34, P＜0.01）。COX-2的表達與HIF-1α的表達有關，HIF-1α陽性表達組COX-2的陽性表達率（51.8%）明顯高于HIF-1α表達陰性組（14.3%），差異具有統計學意義（χ2=3.95, P＜0.05）（表2、表3，圖2）。

圖1 HIF-1α蛋白的表達。A：正常支氣管粘膜上皮細胞HIF-1α蛋白表達陰性（SP, ×100）；B：肺腺癌切片相鄰正常支氣管粘膜上皮細胞HIF-1α陽性表達（SP, ×100）；C, D：HIF-1α在肺腺癌的陽性表達，腺癌細胞胞漿和胞核可見棕黃色顆粒（SP, ×400）。Fig 1 Expression of HIF-1α Protein. A:negative expression in normal bronchial epithelium cells (SP, ×100)； B: positive expression in normal bronchial epithelium cells next to the lung adenocarcinoma (SP,×100)； C, D: positive expression in the lung adenocarcinoma cells of which there are many brown particles in the cytoplasm and cytoblast (SP, ×400).

表1 HIF-1α的蛋白表達與臨床病理資料的關系Tab 1 Correlation between HIF-1α expression and clinicopathological factors in 45 patients with lung adenocarcinoma

圖2 COX-2蛋白的表達。A：COX-2蛋白在肺腺癌的陽性表達，胞漿棕黃色的顆粒（SP，×100）；B：COX-2在正常支氣管粘膜上皮細胞的陰性表達（SP，×100）；C, D：COX-2在肺腺癌陽性表達（SP，×400）。Fig 2 Expression of COX-2 protein. A: positive expression in the lung adenocarcionoma of which there are many brown particles in the cytoplasm (SP, ×100)； B: negative expression in normal bronchial epithelium cells (SP, ×100)； C, D: positive expression in the lung adenocarcionma (SP, ×400).

表2 COX-2的蛋白表達與臨床病理資料的關系Tab 2 Correlation between COX-2 expression and clinicopathological factors in 45 patients with lung adenocarcinoma

圖3 E-cadherin蛋白的表達。A：E-cadherin在正常支氣管粘膜上皮細胞的正常表達，胞膜可見棕色顆粒沉著（SP，×100）； B： E-cadherin在正常支氣管粘膜上皮細胞的正常表達（SP，×400）；C：E-cadherin蛋白在高分化腺癌的表達（SP，×100）；D：E-cadherin蛋白在中分化腺癌的表達（SP，×100）；E：E-cadherin蛋白在低分化腺癌的表達（SP，×100）；F：E-cadherin蛋白在肺腺癌相鄰正常支氣管粘膜上皮的表達（SP，×100）。Fig 3 Expression of E-cadherin protein. A:positive expression in normal bronchial epithelium cells of which there are many brown particles in the cell membrance(SP, ×100)； B: positive staining in normal bronchial epithelium cells (SP,×400)； C: expression in the lung welldifferentiated adenocarcinoma (SP, ×100)； D: expression in the lung moderatedifferentiated adenocarcinoma (SP, ×100)；E: expression in the lung poor-differentiated adenocarcinoma (SP, ×100)； F: expression in normal bronchial epithelium cells next to the lung adenocarcinoma (SP, ×100).

2.3 E-cadherin的蛋白表達與臨床病理資料的關系 10例正常對照組均見E-cadherin的陽性表達。45例肺腺癌E-cadherin的陽性表達率為48.9%（22/45）。不同性別、年齡組之間E-cadherin的表達無差異（χ2=1.08, P＞0.05；χ2=1.84, P＞0.05）。E-cadherin的蛋白表達與患者是否吸煙無關（χ2=2.78, P＞0.05）。腫瘤最大直徑＞2 cm組E-cadherin的陽性表達率（45.4%）與≤2 cm組（60%）相比差異無統計學意義（χ2=2.07, P＞0.05）。E-cadherin表達在不同分化程度組之間差異具有統計學意義（χ2=7.15, P＜0.05），隨著分化程度下降表達率降低（71.4%, 58.3%, 26.3%）。淋巴結轉移陽性組E-cadherin的陽性表達率（30.4%）與淋巴結轉移陰性組（65.2%）之間的差異有統計學意義（χ2=5.02, P＜0.05）。E-cadherin陽性表達率在術后分期I期組為60%，II期組為50%，III期組為33.3%，三者之間差異無統計學意義（χ2=2.45, P＞0.05）。E-cadherin的表達與HIF-1α的表達無關（χ2=0.24, P＞0.05）（表3、表4，圖3）。

表3 HIF-1α表達與COX-2和E-cadherin表達的關系Tab 3 Correlation among HIF-1α, COX-2 and E-cadherin

3 討論

HIF-1α最早是1992年由Semenza和Wang在低氧的肝細胞癌株Hep3B細胞核提取物中發現的一種核轉錄因子，其由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基單位組成，其轉錄活性主要由HIF-1α的表達水平和穩定性決定[4]。它調控著下游眾多基因如血管內皮生長因子、胰島素樣生長因子、內皮素-1，促紅細胞生成素等的轉錄和表達，是低氧誘導基因轉錄信息傳遞的最主要途徑[5]。低氧是實體瘤發展過程中的普遍現象，而HIF-1α是關鍵調控因子。HIF-1α蛋白表達受細胞內氧濃度的精確調控。大量的體外實驗顯示，在5%的氧含量（50 mmHg）時HIF-1α被激活，隨著氧濃度減少到0.1%-0.2%，其活性逐漸增加，在無氧時消失。腫瘤細胞通過高表達HIF-1α對其下游基因進行調控以適應低氧環境，促進腫瘤生長轉移[6]。一般情況下，HIF-1α在正常組織及良性病變組織中無表達或僅有弱陽性表達，而在一些癌前病變組織、癌組織中過量表達[7]。本研究得到了相似的結論，肺腺癌組HIF-1α的陽性表達率明顯高于對照組，同時我們也發現隨著腫瘤直徑的增大HIF-1α的表達陽性率相應增高，提示細胞缺氧發生在癌前病變之前，持續腫瘤發生的全過程，而HIF-1α異常表達可能是癌變過程的早期行為。

表4 E-cadherin的蛋白表達與臨床病理資料的關系Tab 4 Correlation between E-cadherin expression and clinicopathological factors in 45 patients with lung adenocarcinoma

環氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，是一種膜結合蛋白，有COX-1和COX-2兩種同工酶。COX-1在大多數組織中持續低濃度表達，參與機體生理功能的調節；而COX-2是一種誘導型酶，除部分中樞神經系統及腎臟組織外在正常組織中通常不表達，但在某些病理條件下表達上調。近年來，流行病學、動物實驗、臨床試驗等多方面的證據表明，COX-2與腫瘤的發生和發展有關[8]。COX-2可以通過促進細胞異常增殖、抑制細胞凋亡等機制參與調控腫瘤生長、浸潤轉移及血管形成等諸多病理過程。本研究顯示，與非腫瘤患者的正常肺組織相比，肺腺癌組織中COX-2的表達陽性率明顯升高，COX-2陽性表達與患者腫瘤的大小、淋巴結轉移情況和臨床分期有關，提示COX-2參與了肺腺癌的發生、浸潤和轉移，是肺腺癌發生的一個早期事件和預后不良的指標，其促進肺腺癌發生和發展的機制可能為：①促進腫瘤細胞增殖；②抑制細胞凋亡；③促進腫瘤淋巴管的形成[9]；④刺激血管因子產生，促進血管內皮細胞游走和血管形成[10,11]；⑤參與致癌物的代謝[12]；⑥增強腫瘤細胞的侵襲力[13]。

E-cadherin是一類介導細胞與細胞間互相粘附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，它廣泛存在于上皮細胞中，通過胞漿連環素與細胞骨架蛋白連接，以維護上皮細胞的形態和結構的完整性[14]。E-cadherin表達異常是導致細胞間粘附下降的重要原因。而腫瘤細胞間的粘附下降是導致腫瘤發生、發展的重要原因之一。體外細胞培養提示當腫瘤細胞E-cadherin表達下調或功能障礙時，可導致腫瘤細胞具有侵襲性生長的特點，并容易脫離原發部位向局部淋巴結或遠處轉移[15,16]。目前有關E-cadherin與肺腺癌發生、侵襲轉移及預后的關系報道極少。本研究顯示E-cadherin異常表達與肺癌區域淋巴結轉移有關，有區域淋巴結轉移的腫瘤組織異常表達率明顯高于無轉移者，并且發現E-cadherin表達與肺腺癌細胞的分化程度有關，隨著分化程度下降表達率降低。以上說明E-cadherin不僅與肺腺癌區域淋巴結轉移有關，是判斷肺腺癌淋巴結轉移的一個重要指標，而且與肺腺癌的惡性程度有關。因此E-cadherin可能是臨床判斷肺腺癌淋巴結轉移、癌細胞分化程度及評估預后的一個較好指標。

有學者[17]在肝癌和非小細胞肺癌的研究中發現，COX-2和HIF-1α表達呈正相關性。Csiki等[18]研究發現在A549等多種肺癌細胞株中，HIF-1α可以通過直接結合COX-2啟動子上的HRE反應元件上調COX-2的表達，推測兩者在癌細胞的發生、發展過程中具有協同作用。本研究得出了相似的結果，HIF-1α陽性表達組COX-2的陽性表達率明顯高于HIF-1α表達陰性組，提示COX-2的表達與HIF-1α的表達有關。由此可見COX-2可能是HIF-1α的下游目的基因，受HIF-1α的調控。眾所周知，惡性腫瘤細胞增殖異常迅速，不可避免地造成了低氧的微環境，此時作為急性缺氧的分子標志HIF-1α表達相應增高并同時誘導下游COX-2基因的表達，并可能通過這一下游路徑誘導血管生成，改善低氧的微環境，從而促進腫瘤的發生、侵襲與轉移。而較早提出HIF-1α與E-cadherin之間的關聯是在卵巢癌[3]中：免疫組化提示核染色的HIF-1α與E-cadherin的缺失高度相關，且體外實驗提示了其內在關聯，但通過本研究，我們未能得到相似的結論，研究結果顯示肺腺癌組織中E-cadherin與HIF-1α的表達無統計學意義。分析原因可能與樣本含量相對較少有關，這還有待于做進一步更大樣本的深入研究分析。

總之，惡性腫瘤的形成和轉移是一個多基因、多因子共同作用的結果。通過這個研究提示我們，HIF-1α可能通過調控COX-2的表達，對腫瘤的生長轉移起促進作用；雖然未發現E-cadherin和HIF-1α的相關性，尚需更大樣本的研究，但有一點可以肯定，HIF-1α、COX-2和E-cadherin均參與了肺腺癌細胞的發生、浸潤和轉移。聯合檢測HIF-1α、COX-2和E-cadherin將有助于臨床評估病情和判斷預后。而且近年來，肺腺癌的靶向治療已經作為研究的熱點，有些靶向治療藥物已在臨床上得到了應用并收到了很好的治療效果。隨著研究的深入，HIF-1α、COX-2和E-cadherin相互關系的進一步闡明，多靶點治療可能會為肺腺癌綜合治療提供一個新的武器，從而有助于抑制腫瘤細胞增殖，減少復發和轉移，改善患者的生活質量。