α1胸腺肽減輕放射性肺損傷

余榮 孫宇 蔡慶 李永恒 朱廣迎

隨著工業化程度的提高，大氣污染日益嚴重，肺癌在許多國家和地區的發病率和死亡率均呈上升趨勢。在惡性腫瘤死因中死于肺癌者，男性居首位，女性居第2位或第3位，是嚴重威脅人類健康和生命的常見惡性腫瘤[1]。隨著精確放療技術、放化綜合治療技術的進步，肺癌放療療效越來越高，如日本早期肺癌的放療后5年生存率高達70%-80%[2]，完全可以和手術相媲美。美國和歐洲大規模臨床隨機研究[3-5]也證明：原發灶較大及肺門、縱隔淋巴結轉移的局部晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）放化綜合治療的療效也與手術相似，放療在肺癌治療中的作用十分重要。放射性肺炎是肺癌放療的常見并發癥，也是限制肺癌放療療效進一步提高的主要因素之一。因此，如何避免和減少放射性肺炎的發生是肺癌治療策略的重要組成部分。α1胸腺肽（商品名日達仙）為美國賽生藥品股份公司研制的一種人工合成的胸腺素thymosin alpha-1，是一種較為有效的免疫功能生物反應調節劑，且副反應輕微。α1胸腺肽有明顯的免疫刺激作用和直接的抗病毒、抗腫瘤作用，被廣泛應用于治療腫瘤和免疫缺陷性疾病（慢性病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合癥等）。在放療和化療后應用α1胸腺肽可明顯提高機體免疫狀態，降低感染率，改善生活質量。但胸腺肽與放療同時使用是否會加重放射性肺損傷，目前相關報道很少。本研究通過小鼠放射性肺損傷模型觀察照射與α1胸腺肽結合的肺損傷情況，以探討α1胸腺肽能否減輕或加重放射性肺炎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 將7周-8周雌性C57BL/6J小鼠（19 g左右）飼養一周，使其充分適應環境。分入正常空白對照（C）組、單純照射（RT）組、α1胸腺肽加照射（T+RT）組，共3組。C組每個觀察點3只，RT組前2個觀察點各3只，最后一個觀察點4只；T+RT組前2個觀察點各4只，最后一個觀察點6只；共33只。

1.2 實驗方法 非麻醉狀態下固定小鼠，用6MV-X線、2 cm的放射野照射小鼠胸腔，屏蔽其它部分；照射劑量為15 Gy單次完成。3只-5只同時照射，加4 cm的填充物調整小鼠之間照射劑量的均勻性，照射前用劑量計實測劑量。α1胸腺肽加照射（T+RT）組用α1胸腺肽200 μg/kg腹腔注射，1次/天，連續10 d，于第5天用6MV-X線照射小鼠全肺15 Gy單次完成。α1胸腺肽（美國賽生，粉針劑，3.2 mg/支）用77 mL 0.9%生理鹽水稀釋，濃度為40 μg/mL（200 μg/kg·只）。小鼠購于中國醫學科學院動物研究所，飼養在北京大學臨床腫瘤學院清潔動物室，3只/籠-5只/籠。

1.3 實驗觀察 每月記錄小鼠體重至少1次。實驗后第3、8、24周為觀察點，在每個觀察點終止觀察各組3只-4只小鼠。小鼠處死后先開胸觀察是否有胸水，而后解剖游離全肺，用1 mL生理鹽水連續3次對全肺進行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液并記錄其量，用于細胞數和蛋白含量檢測；全肺福爾馬林固定24 h，石蠟包埋切片后給予HE染色，在光學顯微鏡下評價肺泡壁腫脹和炎性細胞浸潤及肺纖維化情況。HE染色片在切片觀察者不知入組情況下進行，每標本評分2張以上切片，隨機4個以上視野，計算平均值和標準差。肺泡壁腫脹和炎性細胞浸潤評分0分-4分：0分為正常。1分為肺泡壁稍增寬；有少許炎性細胞浸潤，高倍視野下＜10個炎性細胞。2分為肺泡壁明顯增寬；有明顯炎性細胞浸潤，高倍視野下10個-20個炎性細胞。3分為肺泡壁明顯增寬；炎性細胞浸潤布滿肺泡壁。4分為除炎性細胞浸潤布滿肺泡壁外，明顯的肺泡內浸潤。在切片觀察者不知入組情況下進行，每標本評分2張以上切片，隨機4個以上視野，計算平均值和標準差。肺纖維化積分為0分-8分（正常-嚴重）：0分為正常；1分為肺泡或細支氣管壁少許纖維化；2分-3分為中度纖維化而無結構改變；4分-5分有明確的肺泡結構改變和纖維小結；6分-7分為嚴重肺泡結構改變和大片纖維化；8分為完全纖維化[4]。

1.4 實驗檢測 開胸取肺，全肺均在主支氣管上環甲膜處離斷，濾紙吸去肺表面血水，電子天平稱重，肺濕重除以鼠體重乘以100得肺系數[7]。

用PRO-MEASURE蛋白定量試劑檢測肺泡灌洗液蛋白含量，步驟與方法如下：先取100 μL待測樣本置入不同清潔試管內，加入1 mL稀釋的PRO-MEASURE溶液，室溫溫育2 min，595 nm處測吸光度值，通過公式Y（蛋白濃度）=40.277×A595+2.930計算肺泡灌洗液蛋白含量（mg/mL）。肺泡灌洗液細胞計數為鏡下細胞計數板上進行，每樣本檢測2次，計算每毫升肺泡灌洗液的細胞數及分類。

1.5 統計方法 采用Primer統計軟件進行數據分析，采用卡方檢驗分析各組小鼠死亡數以及出現胸水情況的差異，采用t檢驗分析各組間小鼠體重變化、肺系數、肺纖維化積分和肺泡灌洗液中細胞數及蛋白含量差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 死亡情況 T+RT組和RT組小鼠因死亡比例分別為3/14、2/10，T+RT、RT組間差異無統計學意義（χ2=2.219, P=0.330）。

2.2 小鼠一般情況的變化 C組的體重穩定增加。T+RT組與RT組增加幅度較空白對照組低，并于照射后第20周開始小鼠出現不同程度呼吸加快，活動減少，食欲下降，體重下降。T+RT組于20周開始下降，24周時體重有回升。RT組24周明顯下降（P=0.04），但T+RT組與RT組相比差異無統計學意義。

2.3 肺大體改變 在24周終止觀察時，RT組2只均伴有一側大量胸腔積液及一側中等量胸腔積液，而T+RT組和對照組均無明顯胸腔積液（χ2=3.76, P=0.05）。RT組肺系數在第8周、第24周均明顯高于T+RT組，詳見圖1。

2.4 肺泡灌洗液蛋白含量 第3周開始T+RT組與RT組肺泡灌洗液蛋白含量明顯高于對照組，第3周T+RT組為（2.04±0.72）mg/mL，RT組為（2.33±0.46）mg/mL，組間無差異（t=0.66, P=0.54）；第8周T+RT組為（2.13±0.24）mg/mL，低于RT組（3.53±1.27）mg/mL（t=1.94,P=0.11），第24周T+RT組為（1.69±0.72）mg/mL，明顯低于RT組（3.56±0.19）mg/mL（t=3.43, P=0.04），詳見圖2。

2.5 肺泡灌洗液細胞數 第3周T+RT組與RT組的肺泡灌洗液細胞總數、巨噬細胞數、中性粒細胞數分別是50.00±8.64與51.33±37.81 （t=0.06, P=0.96）、7.50±4.43與16.67±16.77 （t=0.92, P=0.45）、24.50±7.19與25.00±16.70（t=0.055, P=0.96）。RT組肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞數均在第8周高于T+RT組，但巨噬細胞數第8周時T+RT組高于RT組。第8周T+RT組與RT組的肺泡灌洗液細胞總數、巨噬細胞數、中性粒細胞數分別是400.50±109.12與609.00±285.93（t=1.20, P=0.33）、121.50±285.93與87.00±88.79（t=-0.73, P=0.50）、186.75±62.52與399.00±189.71 （t=1.86, P=0.19）。第24周T+RT組與RT組的肺泡灌洗液細胞總數、巨噬細胞數、中性粒細胞數分別是19.33±9.87與202.50±6.36（t=22.66, P＜0.01）、6.67±1.15與72.00±12.73（t=9.66, P＜0.01）、 9.33±6.43與49.50±6.36（t=6.87, P＜0.01）。第24周RT組肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞數均明顯高于T+RT組。巨噬細胞數變化情況詳見圖3。

2.6 各觀察點的鼠肺泡壁腫脹與炎性細胞浸潤及纖維化評分 光鏡觀察C組大鼠支氣管、肺泡及肺泡間隔組織結構正常，無充血、水腫及急慢性炎癥等改變。RT組小鼠第3周肺毛細血管充血，肺泡間隔增寬且水腫，可見中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤；第8周肺泡間隔進一步增寬，纖維細胞和膠原纖維增生；有大量中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤，小鼠肺中等支氣管及血管周圍均有炎性細胞聚集；第24周，部分肺泡腔消失，萎縮，肺泡壁斷裂，肺泡腔內可見脫落的肺泡上皮及蛋白滲出液。肺泡隔明顯增寬，炎癥細胞浸潤較第8周時減輕，纖維細胞增生及膠原纖維沉積在肺泡間隔內肺泡炎明顯。T+RT組小鼠第3周肺毛細血管充血，肺泡間隔增寬且水腫，也可見中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤；第8周肺泡間隔進一步增寬，纖維細胞和膠原纖維增生，有大量中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤，小鼠肺中等支氣管及血管周圍均有炎性細胞聚集；第24周，肺呈正常結構，有區域性點灶性纖維化結節，肺泡腔內可見脫落的肺泡上皮及蛋白滲出液，肺泡隔增寬，炎癥細胞浸潤較第8周時減輕，纖維細胞增生及膠原纖維沉積在肺泡間隔內，肺泡炎明顯，第24周時T+RT組的肺泡壁腫脹與炎性細胞浸潤評分和肺纖維化積分明顯低于RT組，P值分別為0.04和0.03，有統計學差異。詳見表1、表2，圖4。

圖1 各組小鼠不同時間肺系數變化情況Fig 1 Mice lung coefficient changes in each group at different time

圖2 各組小鼠不同時間肺泡灌洗液蛋白量變化情況Fig 2 Mice bronchoalveolar lavage fluid protein (BALF) changes in each group at different time

圖3 各組小鼠不同時間巨噬細胞數變化情況Fig 3 Mice bronchoalveolar lavage fluid (BALF) macrophages number changes in each group at different time

表1 小鼠各觀察點的肺泡壁腫脹與炎性細胞浸潤評分Tab 1 Mice alveolar wall swelling and inflammatory cell infiltration score in each group at different time

表2 小鼠各觀察點的肺纖維化積分Tab 2 Mice points of pulmonary fibrosis in each group at different time

圖4 各組小鼠不同時間肺泡壁腫脹與炎性細胞浸潤、肺纖維化情況（HE, ×20）Fig 4 Mice alveolar wall swelling, inflammatory cell infiltration and pulmonary fibrosis in each group at different time (HE, ×20)

3 討論

本研究采用動物模型經小鼠胸水、肺系數、病理組織學肺泡壁腫脹與炎性細胞浸潤評分和肺纖維化積分、肺泡灌洗液的細胞計數、蛋白定量分析，初步證明α1胸腺肽可明顯減輕放射性肺損傷。從小鼠一般情況、肺的大體改變看，本研究顯示在第20-24周時RT組小鼠的體重明顯下降，說明此期間小鼠生活質量明顯下降，而T+RT組在第16-20周時體重已開始下降，但在第20-24周時體重回升，說明雖然放療使小鼠生活質量下降，但α1胸腺肽未加重其影響，反而對小鼠的生活質量有一定改善。但各時點體重變化沒有統計學差異，這可能與實驗的樣本量小有關。24周時，RT組存活的2只小鼠均產生了大量胸腔積液，而T+RT組存活的3只小鼠均未見明顯胸腔積液，胸水產生的只數比具有統計學差異。此外，第8周、第24周T+RT組的肺系數均明顯低于RT組。在肺纖維化的形成過程中由于細胞水腫、炎性滲出、毛細血管充血等因素造成的肺重量增加，是肺系數升高的直接原因。從上述表現可見α1胸腺肽對放射性肺損傷的保護趨勢。

長期以來，胸部腫瘤在放療或放化綜合治療時，急性或亞急性放射性肺炎和晚期肺纖維化是最常見的并發癥，嚴重阻止了通過放療根治癌細胞的機會，增加劑量和肺的治療體積以及合并化療明顯增加放射性肺損傷的幾率[8]。導致肺損傷的細胞與分子生物學機制目前比較公認的是Tsoutsou等[9]的研究觀點，即在輻射導致肺損傷后，早期開始不斷出現一些類似激素樣作用的細胞因子在肺組織間質細胞（炎細胞、組織特異功能細胞和纖維母細胞等）損傷中發揮重要作用，這些細胞因子長期的通過自分泌、旁分泌和內分泌的連鎖反應導致早期的炎癥和晚期肺纖維化，最后表現為明顯的病理改變和臨床癥狀。

α1胸腺肽的是人工合成的胸腺肽，具有誘導T細胞分泌，促進T淋巴細胞亞群發育、成熟并活化的功能，能調節T淋巴細胞亞群的比例，并能增強巨噬細胞的吞噬功能，提高自然殺傷細胞活力，提高IL-1的產生與受體表達水平[10]。在臨床研究方面，周建平[11]報道的隨機對照研究中，30例胸腔內灌注化療藥聯合胸腺肽α1療效明顯優于單純胸腔內灌注化療藥，并能改善臨床癥狀，提高免疫功能，是肺癌并胸腔積液有效治療方法之一。王慧敏等[12]采用隨機、對照、前瞻研究胸腺肽α1提高III期-IV期NSCLC化療療效的作用，共40例，發現與單純化療組相比，胸腺肽α1可提高生活質量和生存率，且無明顯的毒副作用，安全、有效。Garaci等[13]對隨機分組的56例晚期NSCLC患者用順鉑（DDP）、鬼臼乙叉甙（VP-16）、胸腺肽Tα1（1 mg/d, d8-11, d15-18）和小劑量IFN（300萬IU, im, d11, d18），21 d為一療程。在56例完成治療的患者中有24例有效（2例CR，22例PR），總有效率為42.9%，中位生存時間為12.6個月。在聯合治療組未發現明顯的毒性反應。免疫功能監測結果表明：單純DDP+VP-16進行化療后，NK細胞活性和淋巴細胞數量均明顯下降，而聯用胸腺肽和IFN后，免疫抑制受到明顯改善。另一臨床試驗[14]結果表明：在隨機采用異環磷酰胺聯合胸腺肽和小劑量IFN治療的22例晚期NSCLC中，有效率為33%，單用異環磷酰胺化療組有效率僅為10%，而且聯合治療組的毒副作用明顯下降，患者的耐受性明顯增加，并認為其作用機制可能在于Tα1刺激了直接針對腫瘤細胞抗原的特殊淋巴單核細胞系。Garaci等[15]2003年再次報道Tα1可以明顯增加細胞因子的活性，并能減輕細胞毒性藥物的血液毒性。另外An等[16]報道了Tα1對22例進展期肺癌或乳腺癌患者化療所致神經毒性有保護作用。但胸腺肽與放療同時使用是否會加重放射性肺損傷，目前尚無相關報道。本研究發現實驗處理后小鼠胸水、肺系數、肺泡灌洗液的細胞數與蛋白含量和肺纖維化積分均顯示T+RT組比RT組的肺組織損傷明顯減輕。

放射性肺損傷與修復是一連續的損傷與修復交替并存的復雜過程。肺組織受到一定劑量照射后，肺泡II型細胞發生改變，3周-4周恢復正常，導致肺泡內表面活性物質增多[17]。早期肺泡灌洗液內蛋白成分輕微升高，可不伴細胞成分，而后逐漸恢復正常，這些早期改變是局部組織早期損傷反應，可能是電離輻射直接造成的。隨后機體免疫反應或炎性反應發生，肺泡灌洗液中蛋白含量、中性粒細胞和淋巴細胞明顯升高。Inoue等[18]研究發現無特定病原體Wistar雄鼠雙肺接受18 Gy照射后28天通過馬森三染色可見極少量肺泡壁纖維化，照射后56天通過馬森三染色可見相對彌漫的肺泡壁纖維化，照射后巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞開始升高，分別在第28天、第56天達高峰，蛋白含量升高。許多文獻[19-24]報道照射后早期1周-2周內蛋白成分無明顯增加，照射后1個月左右蛋白和細胞成分才開始升高。本研究結果與之類似，肺泡灌洗液內蛋白和細胞成分從第3周開始升高，第3周時T+RT組與RT組并無明顯差異。在第8周RT組肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞數均高于T+RT組，可見α1胸腺肽并未加重炎癥反應，反而有減輕反應的趨勢。在第24周RT組肺泡灌洗液細胞數、蛋白含量均明顯高于T+RT組，初步顯示出α1胸腺肽對放射性肺損傷的保護作用。

從病理變化來看，急性放射性肺炎其特征為肺泡萎陷、膨脹不全及血管內物質滲入肺泡腔，肺泡II型細胞細胞漿內板層小體減少，細胞變形、腫脹脫落入肺泡腔內，血管內皮細胞超微結構改變，細胞呈多型性，細胞內空泡形成，內皮細胞脫落，血管滲透性增加，這提示II型肺泡上皮細胞和血管內皮細胞有可能是放射性肺損傷的靶細胞。此時可以出現咳嗽、呼吸困難、發熱等癥狀，但也可以沒有臨床表現。經過一段時間后，臨床癥狀可能有所減輕，但組織學改變將繼續發展，膠原沉積，毛細血管閉塞，肺泡間隔增厚，逐漸進入纖維化期[25]。但至今為止，沒有發現任何一個因子可以對致病過程起獨立的決定性作用，這顯示肺的放射性損傷過程實質上是一個復雜的多方面的過程，是由涉及到的多種因子相互作用所引起的一個長期的過程。這些持續存在的細胞因子相互作用的逐漸增強，導致了致纖維化細胞因子的表達，最后產生了晚期損傷的特征性表現纖維化[26]。本研究中觀察到小鼠肺部的變化與上述描述相符，RT組小鼠第3周肺毛細血管充血，肺泡間隔增寬且水腫，可見中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤，第8周肺泡間隔進一步增寬，纖維細胞和膠原纖維增生；有大量中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤，小鼠肺中等支氣管及血管周圍均有炎性細胞聚集，第24周部分肺泡腔消失、萎縮，肺泡壁斷裂，肺泡腔內可見脫落的肺泡上皮及蛋白滲出液。肺泡隔明顯增寬，炎癥細胞浸潤較第8周時減輕，纖維細胞增生及膠原纖維沉積在肺泡間隔內肺泡炎明顯。T+RT組小鼠的變化與單純放療組相似，但第24周時，仍可見肺部呈正常結構，有區域性點灶性纖維化結節，肺泡腔內可見脫落的肺泡上皮及蛋白滲出液，肺損傷明顯輕于RT組，進一步顯示了α1胸腺肽對放射性肺損傷的防治作用。

肺泡巨噬細胞是肺臟的重要細胞，不但參與肺的防御及免疫，而且能分泌多種生物活性物質。慢性炎癥中，巨噬細胞聚集并持續存在。其來源主要是從血液循環中不斷募集單核細胞，離開血流游出血管后的單核細胞，轉變為巨噬細胞。這是粘附分子和趨化因子持續穩定表達的結果。有文獻[27]報道，局部一次大劑量照射后2周-3周，肺巨噬細胞數明顯下降，4周-8周逐漸恢復到正常水平。本實驗觀察到RT組照射后24周時，大量肺泡腔可見巨噬細胞，大量出現較T+RT組晚，也許與射線在早期引起巨噬細胞損傷，而α1胸腺肽能誘導T細胞分泌，促進T淋巴細胞亞群發育、成熟并活化，同時調節T淋巴細胞亞群的比例，并增強巨噬細胞的吞噬功能有關。巨噬細胞激活后釋放的成纖維細胞生長因子能夠促進成纖維細胞的增生，并合成和分泌大量的膠原纖維使肺組織纖維化[28]。這可能是引起放射性肺纖維化的重要原因之一。本研究發現，α1胸腺肽并沒有加重其炎癥反應，反而減輕了放射性肺損傷，但其具體機制尚不明確。

總之，本研究采用動物模型經小鼠胸水、肺系數、病理組織學肺泡壁腫脹與炎性細胞浸潤評分和肺纖維化積分、肺泡灌洗液的細胞計數、蛋白定量分析，初步證明α1胸腺肽與照射同期使用可明顯減輕放射性肺損傷的發生，確切結論還有待進一步研究。