磁流體熱療對體外人肺癌細胞A549的影響

王國卿 李滸 胡潤磊 柯賢福 魏東山 孟文

肺癌是嚴重危害人類生命健康的常見疾病，發病率高，預后較差。傳統的手術、化療以及放療可使部分患者受益。但是大部分患者在確診時多失去手術機會[1]。因此，臨床上迫切需要采取另一種有效的辦法來治療肺癌。

腫瘤熱療（或稱加溫治療）是近年來發展較快的一種治療方法，傳統的熱療方法均有靶向性差的特點，常導致周圍正常組織損傷，因此應用比較局限。磁流體熱療（magnetic fluid hyperthernia, MFH）是將納米技術和熱療相結合的一種新興熱療方法。Jordan等[2]率先開展了此方面的研究。將納米級的磁流體直接注射到腫瘤內部，在交變磁場的作用下磁流體通過Neel機制升溫至有效的溫度[3]，從而殺死腫瘤細胞，而周圍正常組織沒有磁流體的分布，不升溫或升溫不明顯，因此具有高度的靶向性和特異性。

近年來，國內外學者在此方面做了部分研究工作，研究主要集中在實驗研究階段，涉及到的腫瘤主要有黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、神經膠質瘤等[4-7]。研究證實，磁流體熱療可以抑制腫瘤的生長，延長生存期，但是涉及到人肺癌的研究未見報道。為此，本研究從體外研究Fe3O4磁流體在交變磁場下對人肺癌細胞A549的作用及其作用機制，從而為體內抗腫瘤實驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑 MTT、DMSO、胰蛋白酶、RPMI-1640均由Sigma公司提供。

1.1.2 細胞株 人肺癌細胞株A549由杭州昊天生物有限公司提供，用含10%胎牛血清RPMI-1640培養液。

1.1.3 磁流體 納米級Fe3O4顆粒，采用化學共沉淀法制成膠體混懸液，呈黑色。樣品粒徑范圍為10 nm-40 nm，磁飽和強度是360 GS。樣品使用前均以超聲波處理5 min，使Fe3O4顆粒分布更均勻（圖1）。

1.1.4 主要儀器設備 高頻感應加熱機（型號：SP-04AC 4 KW）：深圳市雙平電源技術有限公司提供，頻率為100 KHz-250 KHz，感應線圈，由4匝直徑為4 mm的銅管平行繞成內徑為3 cm、長為4 cm的線圈，銅管內通循環水。流式細胞儀（型號EPICS XL型）：美國Coulter公司產品。透射電鏡（JEM-1230型透射）：日本JEOL公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞計數法觀察各組人肺癌細胞的生長曲線 將1×105/mL的細胞懸液接種于10 cm2培養瓶中，按分組A、B、C、D、E順序加入含有不同濃度磁流體的培養液，使終濃度分別為0 mg/mL、1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、4.5 mg/mL、6.0 mg/mL，每瓶3 mL，每個時間點設置3瓶，交變磁場作用30 min，參照文獻[8]繪制生長曲線。

1.2.2 MTT法觀察人肺癌活細胞的光密度值及殺傷率 取對數生長的人肺癌細胞A549，將細胞調成1×105/mL的濃度，設置對照組（A組）和實驗組，實驗組按B、C、D、E順序加入含Fe3O4磁性納米粒的RPMI-1640培養液，每瓶3 mL，使各組終濃度分別為1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、4.5 mg/mL、6.0 mg/mL，以沒有加磁流體的RPMI-1640培養液作為A組，交變磁場作用30 min，參照文獻[9]行MTT實驗。用酶標儀590 nm處測量光密度值（optical density, OD），取均值，計算細胞生長抑制率[即殺傷率（cytotoxity index, CI）]=（1-OD處理/OD對照）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測各組肺癌細胞的細胞周期及凋亡率繼續將上述5組含Fe3O4磁性納米粒的培養液調成終濃度為1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、4.5 mg/mL和6.0 mg/mL，每瓶3 mL，每組均為3瓶，磁場作用30 min，培養24 h，胰酶脫壁，制成單細胞懸液，75%乙醇后固定后置4oC冰箱中過夜，用Rnase A（終濃度為20 μg/mL）消化RNA，37oC孵育30 min，流式細胞儀檢查各組肺癌細胞的凋亡率和細胞周期的變化。

1.2.4 光學及電子顯微鏡觀察細胞形態 上述5組細胞磁場作用30 min后，繼續培養24 h，0.25%胰酶脫壁，加入RPMI-1640 1 mL制成單細胞懸液，細胞貼壁生長24 h，繼續培養48 h，光學顯微鏡下觀察細胞形態的變化。然后用0.25%胰酶消化細胞，800 rpm離心5 min、PBS（pH7.4）洗2次、4%預冷戊二醛4oC固定過夜，1%的鋨酸溶液固定樣品1 h-2 h，將經過滲透處理的樣品包埋起來，70oC加熱過夜，在Reichert超薄切片機中切成70 nm-90 nm的薄片，用檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15 min，透射電鏡觀察。

1.3 統計學處理 利用SPSS 13.0軟件包進行方差分析，數據用Mean±SD表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組溫度的變化 隨著磁流體中Fe3O4濃度的增加，升溫越快，峰值溫度越高，B組峰值溫度為40.1oC，C組的峰值溫度為42.5oC，D組的峰值溫度為45.1oC，E組峰值溫度為49.1oC。

2.2 人肺癌細胞A549的生長曲線 隨著時間的延長，A組肺癌細胞數逐漸增加。12 h內B組和C組細胞增長受到輕度抑制，但培養24 h后肺癌細胞計數逐漸增加；對于D組和E組，隨著時間的延長，肺癌細胞增殖受到明顯抑制。加溫后24 h，A組的細胞計數為（17.9±0.3）×104/mL，D組的細胞計數為（5.4±0.1）×104/mL，E組的細胞計數為（1.3±0.1）×104/mL，與對照組比較，均有明顯差異（P＜0.01）；加溫后48 h，對照組細胞計數為（46.1±0.9）×104/mL，D組的細胞計數為（5.9±0.4）×104/mL，與對照組比較，均有明顯差異（P＜0.01），而加溫后48 h E組的細胞全部死亡。具體細胞生長曲線見圖2。

2.3 各組人肺癌細胞A549的光密度值及殺傷率 隨著磁流體濃度的增加，5個組OD值逐漸變小，CI值逐漸增大，殺傷率增加。A組的OD值為0.17±0.01，B組OD值為0.17±0.01，C組OD值為0.15±0.02，D組OD值為0.07±0.02，E組OD值為0.05±0.02。

2.4 流式細胞儀檢測人肺癌細胞A549的凋亡率及細胞周期 流式細胞術檢測A組、B組、C組、D組、E組人肺癌細胞A549的凋亡率分別為（2.41±0.20）%、（6.30±0.80）%、（14.22±1.60）%、（27.06±1.20）%和（49.53±3.10）% ，與A組比較，有明顯差異（F=413.243,P＜0.001）（圖3）。流式細胞術檢測A組、B組、C組、D組、E組人肺癌細胞A549的細胞周期提示，人肺癌細胞A549細胞G1期細胞隨著Fe3O4濃度的增加呈現明顯減少趨勢，S期和G2期細胞呈現逐漸增加的趨勢；D組與E組的細胞周期間無明顯差異（P＞0.05）（表1）。

圖1 磁流體粒子的電鏡照片。照片顯示粒子直徑在10 nm-40 nm之間（×200萬）Fig 1 SEM images of magnetic fluid particle. The picture showed that the diameter of the particle was about 10 nm-40 nm (×2,000,000).

圖2 各組人肺癌細胞A549生長曲線比T較imeFig 2 The growth curve of cells in different groups

圖3 磁流體熱療后各組人肺癌細胞凋亡和周期圖Fig 3 The apoptosis of A549 cells were observed and the cells were arrested at the stage S

2.5 光學及電子顯微鏡觀察細胞形態 倒置光學顯微鏡下觀察各組細胞形態變化，A組和B組（40.1oC）細胞大小基本一致，無細胞破裂，細胞數較多，生長旺盛。C組、D組、E組隨著磁流體濃度的升高，正常細胞數逐漸減少，壞死細胞及細胞碎片逐漸增多（圖4）。通過電鏡觀察發現，熱療后細胞染色質濃集、胞漿空泡化、細胞核裂解，其中由于溫度達到49.1oC，E組細胞核呈現溶解，正常細胞結構消失，呈壞死表現（圖5）。

3 討論

肺癌的發病率和死亡率已居所有癌癥之首[10]，由于早期肺癌沒有明顯的臨床癥狀，大部分病例發現時均屬晚期，手術效果差。傳統的放化療由于毒副作用大且價格昂貴，多數患者不能耐受；傳統的熱療方法如射頻、微波、超聲等均有加溫的特異性差、不能針對某一特定靶區加溫的缺陷，大大降低了熱療的效果。因此探索一種治療效果好、副作用小的熱療方法成為廣大從事肺癌研究學者的目標。

表1 各組人肺癌細胞A549細胞周期變化Tab 1 Comparison of cell cycles of A549 cells among different groups

圖4 磁流體熱療后各組人肺癌細胞的光鏡下形態學改變（×400）。A（Control組）和B（Fe3O4 1.5 mg/mL組）：細胞生長形態基本差別不大，呈梭形，分布規則，胞核清晰突出；C：Fe3O4 3.0 mg/mL組，細胞開始出現死亡；D：Fe3O4 4.5 mg/mL組，隨著溫度升高，死亡的細胞越多；E：Fe3O4 6.0 mg/mL組，細胞全部死亡。Fig 4 Changes in cell morphology were observe by light microscopy (×400). A (Control group) and B (Fe3O4 1.5 mg/mL group): The human being carcinoma A549 cells have no evident changes； C (Fe3O4 3.0 mg/mL group)and D (Fe3O4 4.5 mg/mL group): Most of the human being carcinoma A549 cells were observed to have cell death, karyopyknosis by light microscopy； E (Fe3O4 6.0 mg/mL group): All cells were observed to have cell death.

磁流體熱療的優點主要是其高度的靶向性和特異性[11]，因此它是一種非常有前途的腫瘤治療方法。在體外，我們探討了不同溫度條件下磁流體熱療對人肺癌細胞的影響。結果發現，磁流體的溫度與其濃度呈量效關系，濃度大，峰值溫度高，對肺癌細胞的增殖抑制作用越明顯。研究發現，4個實驗組中，最低濃度B組（1.5 mg/mL）峰值溫度為40.1oC，未達到熱療的有效范圍溫度[11]，對肺癌細胞的增殖無明顯抑制，而C、D、E三組的溫度均達到了有效熱療溫度，細胞的生長受到抑制。其中最高濃度的E組（6.0 mg/mL）峰值溫度為49.1oC，人肺癌細胞的生長受到明顯的抑制，48 h后細胞幾乎全部死亡。這說明可以通過控制磁流體的劑量來實現熱療的控溫[12]，從而選擇有效的溫度來殺死腫瘤細胞，達到治療的目的。

研究證實，熱療可以通過直接物理作用造成正常細胞和腫瘤細胞的凋亡和壞死[13]，且溫度越高，凋亡越明顯[14]。凋亡是一種細胞主動自殺的過程，是細胞死亡的一種特定形式，凋亡有其自身的特征性改變，包括形成DNA碎片、染色質邊集、胞漿空泡化、細胞皺縮以及形成凋亡小體等[15,16]，研究[17]發現，腫瘤細胞在42.0oC的條件下就可以凋亡。我們的實驗結果發現，濃度≥3.0 mg/mL時，峰值溫度≥42.5oC，細胞增殖開始受到抑制，溫度越高，抑制越明顯。電鏡下可見明顯的凋亡改變。流式細胞術檢測發現，隨著溫度的增高，凋亡率越高。其中E組（6.0 mg/mL, 49.1oC）的肺癌細胞48 h后幾乎全部凋亡、壞死，說明溫度越高凋亡越明顯，治療效果越好。

圖5 磁流體熱療后各肺癌細胞電鏡觀察圖（×8,000）。A（Control組）：正常A549肺癌細胞的電鏡下表現；B（Fe3O4 1.5 mg/mL組）：肺癌細胞熱療后電鏡觀察無明顯改變；C（Fe3O4 3.0 mg/mL組）：肺癌細胞熱療呈凋亡樣改變，表現為染色體邊聚；D（Fe3O4 4.5 mg/mL組）：肺癌細胞熱療后表現為核碎裂，也是凋亡的一種形態學表現；E（Fe3O4 6.0 mg/mL組）：在49.1 oC較高溫度條件下表現為壞死樣改變，細胞正常形態消失，核溶解，大量細胞碎片形成。Fig 5 Changes in cell morphology were observed by electron microscopy (×8,000). A (Control group): Normal human being carcinoma A549 cell； B (Fe3O4 1.5 mg/mL group): A549 cells does not have apparent change； C (Fe3O4 3.0 mg/mL group): A549 cells were observed to have margination；D (Fe3O4 4.5 mg/mL group): A549 cells were observed to have a form of nuclear fragmentation in apoptosis by electron microscopy； E (Fe3O4 6.0 mg/mL group): Necrosis were observed at 49.1 oC.

真核細胞周期分為有絲分裂期和間期，細胞的生長、分裂依次經過G1期、S期、G2期、M期，至于熱療后對細胞周期各期的阻滯均有報道[18-22]，我們用流式細胞儀測定熱療后人肺癌A549細胞周期的變化，結果表明磁流體熱療后細胞周期發生了明顯的改變，G1期細胞減少，S期和G2期細胞增多。說明磁流體熱療后人肺癌A549細胞出現S期阻滯。S期是細胞周期進程中一個十分重要的階段，此階段主要是大量的DNA復制過程，同時也合成組蛋白和非組蛋白，最后完成染色體的復制。因此S期的阻滯對DNA的復制產生了巨大的影響，進而導致細胞凋亡。

盡管學者們對熱療治療腫瘤的機理做了大量的研究，其中誘導凋亡、導致壞死、阻滯細胞周期是目前大家比較認可的機制之一，但確切的機制尚無定論，磁流體熱療的確切機制同樣有待于進一步研究。本實驗通過不同濃度的Fe3O4磁流體在交變磁場作用下在體外對肺癌細胞的影響的研究，初步證實磁流體熱療可以明顯抑制人肺癌A549細胞的增殖，誘導其凋亡、導致壞死、阻滯細胞于S期，是磁流體熱療對人肺癌研究的一個切入點，其結果必將為磁流體熱療在肺癌領域的進一步研究打下良好的基礎。