非小細胞肺癌原發灶與相應轉移灶之間EGFR基因突變狀況的不一致性研究

方勤 張亮 王思愚 區偉

肺癌是全世界癌癥死亡的常見病因之一，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占原發性肺癌的80%，而其中55%的患者在診斷時就已經是局部晚期或遠處轉移[1]。雖然以鉑類為基礎的聯合化療已經提高了中位生存時間，但這部分患者的預后仍然很差，平均5年生存率不足5%[2]。近年來酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）分子靶向治療問世，使晚期NSCLC治療取得較大的突破，具有療效明顯、毒副作用小、耐受性好的優勢，逐漸成為研究熱點之一[3-5]。

在探索哪些患者能獲益于TKI治療的過程中，研究者發現表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變是晚期NSCLC患者獲益于TKI治療的預測因子[6-10]。EGFR基因定位于人第7號染色體短臂，由118 kb組成，包括28個外顯子，其中第18-21號外顯子編碼TK區域。EGFR基因的眾多突變中，89%都位于第19、21號外顯子；這兩個位點突變已經被證實與TKI治療有效有關[3]。數項前瞻性及回顧性研究[11-16]證實EGFR基因突變陽性的患者對TKI（吉非替尼或厄洛替尼）治療有效率為70%-80%，能有效延長無進展生存時間（progressionfree survival, PFS）、提高生活質量，其中位生存時間達20個月-30個月。

在局部或者晚期的NSCLC患者中，決定是否使用TKI治療時檢測EGFR基因突變的標本多是選取原發灶或者轉移灶。在臨床工作中，由于穿刺活檢或經支氣管鏡活檢獲取原發灶的組織量不夠，采用轉移灶特別是體表淋巴結作為EGFR突變狀況檢測較多。然而目前在原發灶與轉移灶之間EGFR基因突變狀況是否存在一致性尚不明確。Park[17]研究發現在原發腫瘤與轉移淋巴結之間，用直接測序法檢測EGFR基因突變狀況的不一致率為11.9%（12/101），而同時用異源雙鏈分析法檢測其不一致率為16.8%（17/101）。最近同類研究也顯示在NSCLC原發灶與相應轉移灶之間EGFR基因突變狀況的不一致率分別為27%（18/67）[18]、33%（16/45）[19]、28%（7/25）[20]。

本研究旨在通過比較NSCLC原發灶與轉移灶之間EGFR基因突變狀況，探索二者之間是否存在不一致性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 研究的入組標準如下：①完整切除原發病灶的NSCLC患者；②相應的轉移病灶有足夠多的癌組織可行EGFR基因突變檢測；③既往未接受過TKI治療；④患者年齡＞18歲。2008年1月-2010年3月共收集了40對NSCLC原發灶及相應轉移灶標本，其中5對標本因轉移灶標本量太少，無法行EGFR基因突變檢測而排除，最后共35對標本入組。

記錄病例的臨床病理資料，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理分型、腫瘤分化情況、術后的病理分期等。術后的病理分期根據IASLC 2009年制定的NSCLC分期標準進行評定[21]，腫瘤的分期與腫瘤發生時的診斷一致。腫瘤組織的病理分型根據2005年WHO標準進行評定[22]。吸煙史在患者第一次就診時獲得，吸煙狀態分為：①不吸煙者（一生中吸煙＜100支）；②曾經吸煙者（術前12個月內不再吸煙）；③現時吸煙者（術前12個月內有吸煙并且≥100支）[9]。所有患者已經被告知并同意使用其標本用于分子和病理學分析。該試驗已獲得醫院倫理委員會的批準。

1.2 實驗方法 本研究中所使用的EGFR基因檢測方法為TaqMan RT-PCR[23]。本次應用的EGFR基因檢測試劑盒共檢測EGFR基因19號外顯子三種堿基缺失突變（A: Nucleotide 2240-2251del, Amino acid L747-A750del;B: Nucleotide 2235-2249del, Amino acid E746-A750del; C:Nucleotide 2240-2257del, Amino acid L747-S752del）及21號外顯子2種堿基置換突變（D: Nucleotide 2573 T＞G, Amino acid L858R; E: Nucleotide 2582 T＞A, Amino acid L861Q）共5個最常見突變位點。

實驗大致過程如下：①兩位病理科醫生分別在顯微鏡下核對石蠟組織的HE染色玻片，選取腫瘤組織＞80%的石蠟塊；②切取每片10 μm厚的蠟片4張；③使用TIANamp基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH,北京) 從切片中提取出原發肺癌組織和轉移灶的基因組DNA；④進行DNA提取物的驗證：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）管家基因（300 bp）PCR擴增，GAPDH基因擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈照射下進行拍照（沒有PCR擴增條帶的標本需再次切片，再次提取DNA）；⑤把成功提取的DNA放入EP管中并分別加入EGFR基因檢測試劑盒（GP Medical Technologies, Beijing, China）中的正向引物、反向引物、探針等；⑥把標本放入ABI7900 RT-PCR機（Esco Technologies, Inc., St. Louis, MO, USA）上進行擴增[24]；⑦應用SDS 2.0軟件對擴增曲線進行分析并判斷EGFR基因突變陰、陽性。

1.3 統計方法 統計分析采用SPSS 16.0統計學軟件。計數資料分析采用Fisher's檢驗。P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 患者的一般情況 35對NSCLC病例的配對標本中，原發灶均是已經完整切除的肺部病灶，35例配對的轉移灶中，29例是縱隔淋巴結轉移灶（9枚隆突下淋巴結，8枚主動脈下淋巴結，8枚下氣管旁淋巴結，4枚上氣管旁淋巴結），4例是腦轉移病灶，2例是鎖骨上淋巴結轉移灶。所有病例在獲得腫瘤標本前未曾接受過EGFR靶向治療。病例的一般情況數據如下：中位年齡為57歲（38歲-72歲）；女性14例（40%），男性21例（60%）；病理學類型為：鱗癌1例（2.9%），腺鱗癌3例（8.6%），腺癌31例（88.5%）；腫瘤分期：IIIa期24例（68.6%），IIIb期3例（8.6%），IV期8例（22.8%）；吸煙史：不吸煙者16例（45.8%），既往吸煙者13例（37.1%），現時吸煙者6例（17.1%）。

2.2 NSCLC原發病灶和轉移灶的EGFR基因突變狀況 EGFR基因突變RT-PCR擴增曲線見圖1。在這項研究中，原發肺癌病灶中有29例（29/35, 82.86%）為EGFR基因突變型，余下6例為EGFR野生型。29例原發肺癌病灶EGFR突變類型分別為第19號外顯子突變15例、第21號外顯子突變14例。其中第19號外顯子突變中均為E746-A750缺失；第21號外顯子突變中13例為第858位密碼子堿基替換突變，1例為第861位密碼子堿基替換突變。

35例轉移灶中18例（18/35, 51.43%）為EGFR基因突變型，17例為EGFR野生型。18例EGFR基因突變型轉移灶的具體突變類型為：第19號外顯子突變11例、第21號外顯子突變7例。其中第19號外顯子突變中均為E746-A750缺失；第21號外顯子突變中均為第858位密碼子堿基替換突變（表1）。

2.3 原發NSCLC病灶和相應轉移灶的EGFR基因突變狀況比較 6例NSCLC原發灶為EGFR基因野生型的病例，其相應的轉移灶分別為：3例腦轉移病灶、2例鎖骨上淋巴結轉移灶和1例上氣管旁淋巴結轉移灶，這6例轉移灶的EGFR基因均為野生型，與原發病灶一致。

29例原發灶EGFR基因突變型的病例中，只有18例EGFR基因突變，而其余11例轉移灶為EGFR基因野生型。18例EGFR突變型的轉移灶中，11例為第19號外顯子突變，病灶分別為：3例下氣管旁淋巴結轉移灶、3例隆突下淋巴結轉移灶、3例主動脈下淋巴結轉移灶及2例上氣管旁淋巴結轉移灶，第19號外顯子突變均為E746-A750缺失；另外7例為第21號外顯子突變，其相應轉移灶分別為：2例下氣管旁淋巴結轉移灶、2例隆突下淋巴結轉移灶、2例主動脈下淋巴結轉移灶及1例腦轉移灶，第21號外顯子突變均為第858位密碼子堿基替換突變。轉移灶的EGFR基因突變位點與原發病灶的突變位點一致。

11例（11/35, 31.43%, P=0.008）原發灶EGFR基因突變陽性而轉移灶為EGFR基因野生型的患者其轉移灶分別為：4例隆突下淋巴結轉移灶、3例下氣管旁淋巴結轉移灶、3例主動脈下淋巴結轉移灶。其原發灶EGFR基因突變類型為：第19號外顯子突變4例（均為E746-A750缺失）、第21號外顯子突變7例（6例為第858位密碼子堿基替換突變，1例為第861位密碼子堿基替換突變），其相應轉移灶均為EGFR基因野生型，與原發灶EGFR基因表達不一致。

圖 1 EGFR基因突變檢測RT-PCR擴增曲線。A：19號外顯子E746-A750del；B：21號外顯子L858R E。Fig 1 RT-PCR amplification curve of EGFR gene mutations analysis. A: exon 19. Amino acid L747-A750del; B: exon 21, Nucleotide 2573 T＞G.

35例原發NSCLC病灶與相應轉移灶配對標本中，11例（31.43%, P=0.008）標本出現原發灶EGFR基因突變，而轉移灶為EGFR基因野生型，18對原發灶及轉移灶均為EGFR基因突變型，且突變具體位點相同，6對原發灶及轉移灶均為EGFR基因野生型。研究結果顯示轉移灶與原發灶的EGFR基因表達存在不一致性，其不一致率為31.43%（11/35, P=0.008）。

3 討論

在晚期NSCLC患者中EGFR突變者對TKI治療的反應率及PFS均較EGFR野生型者明顯升高。檢測EGFR基因突變來篩選獲益于TKI治療的患者已經推廣使用。目前轉移病灶的EGFR基因狀況是否與原發病灶保持一致尚不明確。當晚期NSCLC患者在決定是否使用EGFR TKI治療時，進行EGFR基因突變狀況檢測，是否原發病灶與轉移病灶同時檢測更合適，也無法定論。

本研究比較了NSCLC原發病灶與相應轉移病灶之間EGFR基因突變狀況的一致性，共檢測了35對配對的原發肺癌病灶與相應轉移灶的EGFR基因。研究結果顯示轉移灶與原發灶的EGFR基因表達存在不一致性。入組病例中有11例（31.43%）出現原發灶EGFR基因突變，而其對應的轉移灶為EGFR基因野生型。這一發現與最近幾項同類研究的結果相似， Park和Gow等研究結果顯示在NSCLC原發灶與相應轉移灶之間EGFR基因表達的不一致率分別為11.9%（12/101，直接測序法），16.8%（17/101，異源雙鏈分析法）[17]、27%（18/67，TaqMan RT-PCR法)[18]、33%（16/45，免疫組化）[19]、28%（7/25，直接測序法）[20]。各個實驗檢測EGFR基因突變的方法不同及病例入組標準的差異可能是造成不一致率存在差異的原因。

表 1 原發灶與相應轉移灶的EGFR基因突變狀況Tab 1 EGFR mutations in primary and corresponding metastatic tumors

然而，某些研究卻發現相反的結果。Matsumoto在研究中有8例肺腺癌腦轉移灶患者可找到相應的肺部原發病灶，其中6例腦轉移灶和肺部原發病灶均為EGFR基因突變型，表達一致[25]。另一個研究[26]對比8例肺癌患者原發灶與轉移灶的基因表達，EGFR基因、KRAS、P53在原發灶與轉移灶之間都保持了一致性。然而這些研究的入組病例數都很少。

EGFR TKI治療在EGFR基因突變型晚期NSCLC患者中有明顯療效，能有效延長PFS、提高生活質量[11-16]。TKI治療是否是晚期肺癌患者合適的治療，根據EGFR突變類型來選擇是關鍵，然而EGFR基因在原發灶與轉移灶之間存在著不一致性，所以如果對肺癌原發灶及轉移灶同時進行EGFR基因檢測，可能對患者的治療有更好的指導意義。

總之，本實驗發現在NSCLC原發病灶與轉移灶之間的EGFR基因狀況的不一致率為31.43%。這種原發灶與轉移灶EGFR基因狀況的不一致性可能對晚期NSCLC患者選擇EGFR TKI治療有一定程度的影響，同時也是將來相關臨床試驗設計時需考慮到的因素之一，尚有待大樣本量的研究來進一步驗證其臨床意義。