β-arrestin 2在非小細(xì)胞肺癌患者血清中表達(dá)的臨床意義

吳正清 童文俠 譚子輝 王思愚 林鵬

肺癌是一種常見的惡性腫瘤[1]，是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[2]，近年來(lái)我國(guó)肺癌的發(fā)病率及病死率逐年增高，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占85%[3,4]。臨床確診時(shí)的病期是影響肺癌患者預(yù)后的主要因素之一[5]，盡管現(xiàn)代診斷技術(shù)已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但目前針對(duì)肺癌早期診斷的方法仍不盡人意，70%的患者就診時(shí)已經(jīng)是局部晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移[6]，而目前肺癌患者的5年生存率仍然只有14%[7]。因此，尋找能早期發(fā)現(xiàn)和診斷肺癌或者評(píng)價(jià)其預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物已成為目前肺癌臨床和基礎(chǔ)研究的主要方向。β-arrestin 2是一類介導(dǎo)受體脫敏的重要可溶性蛋白質(zhì)，是GPCRs信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，目前在乳腺癌[8,9]和前列腺癌[10]的研究中發(fā)現(xiàn)它對(duì)預(yù)后預(yù)測(cè)具有一定的意義。本研究通過(guò)測(cè)定NSCLC患者血清中β-arrestin 2的表達(dá)情況，初步探討β-arrestin 2表達(dá)與NSCLC分期及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 ①標(biāo)本：本研究所采用的NSCLC患者治療前的血清標(biāo)本全部取自中山大學(xué)腫瘤防治中心的住院病人，所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)確診為NSCLC入院后次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采血，均為治療前階段采血。所采用的正常人血清標(biāo)本均來(lái)自中山大學(xué)腫瘤防治中心體檢的正常健康非腫瘤人群。血標(biāo)本經(jīng)離心后，保存于-80oC冰箱；②試劑：本研究所采用的β-arrestin 2 ELISA試劑盒采購(gòu)自廣州吉泰新繹生物科技公司；③儀器： SpectraMax m5多功能酶標(biāo)儀（Molecular devices公司）、5814型離心機(jī)（Eppendorf公司）、多道移液器（Gilson公司）等。

1.2 臨床基本資料 選取2005年1月-2006年12月在中山大學(xué)腫瘤防治中心就診治療并確診為NSCLC的67例患者及20例正常體檢者的血清標(biāo)本。采集住院患者血標(biāo)本已經(jīng)中山大學(xué)腫瘤防治中心倫理委員會(huì)審核通過(guò)，且均告知患者采集血標(biāo)本之權(quán)利及義務(wù)，并征求患者及家屬同意。NSCLC患者中位年齡為58歲（36歲-75歲）；男性36例（53.7%），女性31例（46.3%）；病理證實(shí)鱗癌28例（41.8 %），腺癌39例（58.2 %）；高分化8例（12%），中分化23例（34.3%），低分化36例（53.7%）；有腫瘤家族史16例（23.9%），無(wú)腫瘤家族史51例（76.1%）；抽煙者27例（40.3%），不抽煙者40例（59.7%）。末次隨訪至2010年11月，隨訪時(shí)間1個(gè)月-68個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為63個(gè)月。分期采用UICC 2002年第6版TNM分期系統(tǒng)，具體病理類型及分期詳見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用ELISA法測(cè)定肺癌及正常人群血清標(biāo)本中β-arrestin 2的表達(dá)情況，并用酶標(biāo)儀測(cè)定。①配制濃度為10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL的β-arrestin 2標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，分別加入A1-A7標(biāo)準(zhǔn)孔中。A8-A9空白孔加樣品稀釋液100 μL。余檢測(cè)孔每孔加待測(cè)樣品各100 μL。酶標(biāo)板上加膜覆蓋，37oC溫育2 h；②棄去液體，甩干，不用洗滌。待干燥后每孔加稀釋抗體各100 μL。酶標(biāo)板上加膜覆蓋，37oC溫育1 h。用200 μL洗滌液洗板3次，待干燥后每孔加酶標(biāo)抗體各100 μL。酶標(biāo)板上加膜覆蓋，37oC溫育30 min；③同上洗板5次后，每孔加底物各90 μL。酶標(biāo)板上加膜覆蓋，37oC溫育約15 min，直到標(biāo)準(zhǔn)孔前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色。然后每孔加終止溶液各50 μL，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值。

1.4 預(yù)后評(píng)價(jià)方法 采用總生存時(shí)間進(jìn)行預(yù)后評(píng)價(jià)。總生存時(shí)間為從確診時(shí)間開始到末次隨訪時(shí)間或死亡時(shí)間。失訪者以末次隨訪時(shí)間計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Mean±SD標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用非配對(duì)t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（P25-P75）表示，兩組間比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。離散型變量的比較采用χ2檢驗(yàn)。生存率計(jì)算用壽命表法，預(yù)后比較采用Kaplan-Meier法，多因素預(yù)后分析采用COX回歸分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)孔的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。相關(guān)系數(shù)r=0.986。

2.1.2 β-arrestin 2測(cè)定結(jié)果 根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定各檢測(cè)孔樣品的OD值，計(jì)算出各孔β-arrestin 2的實(shí)際濃度。β-arrestin 2濃度中位數(shù)為1.000 ng/mL（0.253-1.934）；其中正常人組β-arrestin 2濃度中位數(shù)為2.047 ng/mL（2.000-2.433）；I期患者β-arrestin 2濃度中位數(shù)為1.185 ng/mL（1.000-1.589）；III期患者β-arrestin 2濃度中位數(shù)為0.196 ng/mL（0.084-0.284）；IV期患者β-arrestin 2濃度中位數(shù)為0.356 ng/mL（0.008-0.634）。

2.1.3 β-arrestin 2與臨床病理因素關(guān)系分析結(jié)果 采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)法比較各期NSCLC患者血清β-arrestin 2濃度：I期及III期、IV期患者組別均較正常人組別血清β-arrestin 2濃度低（P＜0.001, P＜0.001, P＜0.001）；I期患者組別較III期、IV期患者組別血清β-arrestin 2濃度高（P＜0.001, P＜0.001），而III期與IV期患者組別血清β-arrestin 2濃度無(wú)明顯差異（P=0.273）。比較不同分化腫瘤程度NSCLC癌患者，高分化與中分化、低分化患者組別血清β-arrestin 2濃度均無(wú)明顯差異（P=0.152, P=0.620,P=0.138）。比較不同病理類型、不同性別、有無(wú)家族史、是否吸煙患者組別血清β-arrestin 2濃度無(wú)明顯差異（P=0.173, P=0.051, P=0.097, P=0.137）（表1）。

2.2 預(yù)后分析結(jié)果 67例NSCLC患者，末次隨訪至2010年11月，隨訪時(shí)間1個(gè)月-68個(gè)月，總的5年生存率為47%。其中I期患者的5年生存率為83%，III期患者的5年生存率為17%，IV期患者的5年生存率為11%。

按照β-arrestin 2濃度的四份位間距將NSCLC患者分為低（0 ng/mL-0.253 ng/mL）、中（0.254 ng/mL-1.000 ng/mL）、高（＞1.001 ng/mL）三組。采用Kaplan-Meier法比較β-arrestin 2高、中、低表達(dá)患者預(yù)后，高表達(dá)患者較中、低表達(dá)患者預(yù)后更好（P＜0.001, P＜0.001），生存曲線見圖2。將腫瘤分期、β-arrestin 2濃度、病理類型、腫瘤分化程度、性別納入COX回歸，COX回歸分析顯示β-arrestin 2濃度和腫瘤分期對(duì)NSCLC患者預(yù)后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003, P=0.004）（表2）。

表 1 β-arrestin 2表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系Tab 1 The relations of clinical and pathologic factors with level of β-arrestin 2

表 2 多因素分析臨床病理學(xué)因素對(duì)總生存時(shí)間的影響Tab 2 The influence of clinical and pathologic factors to total survival time analysed by multiariate COX regression

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 1 The chart of standard curve

圖 2 不同β-arrestin 2表達(dá)患者生存曲線圖Fig 2 The survive curves of patients with different level of β-arrestin 2

3 討論

人β-arrestin 2是一類介導(dǎo)受體脫敏的可溶性蛋白質(zhì)，是GPCRs信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，與GPK聯(lián)合作用，可以使GPCRs對(duì)激動(dòng)劑的敏感性下降，發(fā)生受體的脫敏反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)受體內(nèi)吞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等[11]。Wang等[12]報(bào)道了β-arrestin 2高表達(dá)可以減少M(fèi)dm2引起的p53降解，從而提高了p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。目前在前列腺癌和乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)β-arrestin 2呈降低趨勢(shì)，具有一定的預(yù)后預(yù)測(cè)意義。目前尚未有β-arrestin 2在人類肺癌中的相關(guān)報(bào)道，我們就本研究的結(jié)果初步探討β-arrestin 2表達(dá)與NSCLC分期及預(yù)后的關(guān)系。

Raghuwanshi等[13]報(bào)道在鼠肺癌模型中，β-arrestin 2起到抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用。本研究中，β-arrestin 2在腫瘤患者組血清中明顯降低，同時(shí)在晚期患者組濃度又較早期患者組明顯降低。因此，β-arrestin 2有可能在NSCLC患者的早期診斷中發(fā)揮作用，并可能有助于腫瘤分期的預(yù)判。但進(jìn)一步的驗(yàn)證有待于大樣本量的研究。

本研究中，β-arrestin 2在不同分化程度（高分化、中分化、低分化）NSCLC患者血清中表達(dá)無(wú)差異（P=0.152,P=0.620, P=0.138），不同病理類型、不同性別、有無(wú)家族史、是否吸煙患者組別血清β-arrestin 2濃度亦無(wú)明顯差異（P=0.173, P=0.051, P=0.097, P=0.137）。因此，β-arrestin 2可能與上述臨床病理因素?zé)o明顯關(guān)系。

本組67例NSCLC患者，總的5年生存率為47%，其中I期、III期、IV期5年生存率分別為83%、17%、11%。與Pfannschmidt[14]、劉樹庫(kù)[15]等報(bào)道基本相符。關(guān)于β-arrestin 2表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少，本研究中，Kaplan-Meier法比較β-arrestin 2高、中、低表達(dá)患者預(yù)后，高表達(dá)患者較中、低表達(dá)患者預(yù)后更好（P＜0.001,P＜0.001）。同時(shí)COX回歸分析顯示，β-arrestin 2濃度對(duì)預(yù)后具有明顯意義。因此，β-arrestin 2有可能有助于腫瘤患者預(yù)后的判斷，但也有待于進(jìn)一步大樣本量試驗(yàn)的驗(yàn)證。

綜上所述，血清β-arrestin 2濃度在正常人和NSCLC患者、不同病理分期NSCLC患者血清中有明顯濃度差異。Kaplan-Meier預(yù)后比較和COX回歸分析顯示β-arrestin 2對(duì)預(yù)后具有明顯意義。因此β-arrestin 2可能在對(duì)NSCLC患者的早期診斷、預(yù)判腫瘤分期、預(yù)判預(yù)后等方面發(fā)揮作用。