肺腺癌吉非替尼獲得性耐藥相關microRNAs的篩選鑒定

秦學博 劉彬 李洋 尤嘉琮 周清華

肺癌是世界上死亡率最高的一種惡性腫瘤，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占到了肺癌總數的80%[1,2]。在NSCLC中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）常存在過度表達和異常激活[2]，且EGFR信號通路在癌癥發生、發展、轉移、凋亡等方面有著重要作用。因此，以阻斷EGFR功能為目標的分子靶向治療逐漸應用到臨床[3]。吉非替尼（Gefitinib，商品名為易瑞沙，Iressa）可以特異性地抑制EGFR自身磷酸化，阻斷其信號傳導，從而起到抗腫瘤作用[4]，對老年肺腺癌及復發的NSCLC療效明顯[5,6]。近年來，人們發現幾乎所有對吉非替尼治療有效的病例在經過一定時間的緩解期后都會產生吉非替尼的獲得性耐藥。因此，研究其耐藥機制具有重大的理論和臨床意義[7]。本研究以吉非替尼敏感肺腺癌細胞株PC9與吉非替尼耐藥肺腺癌細胞株PC9/AB11為細胞模型，通過microRNA芯片技術分析比較吉非替尼敏感和耐藥的肺腺癌細胞株的microRNAs表達譜差異，篩選與肺腺癌吉非替尼獲得性耐藥相關的microRNAs。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 本實驗用吉非替尼敏感的人肺癌細胞株PC9細胞，及其衍生的獲得性耐藥細胞株PC9/AB11細胞均由同濟大學附屬上海市肺科醫院腫瘤研究所惠贈。

1.1.2 試劑與材料 RPIM-1640培養基（Gibco公司），小牛血清（Gibco公司），0.25%胰酶（Gibco公司），吉非替尼片（阿斯利康公司），MTT（Sigma公司），miRNeasy Mini Kit（QIAGEN公司），microRNA芯片（Affymetrix公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 細胞使用含10%小牛血清的RPMI-1640培養基置于37oC恒溫、5%CO2的培養箱中培養，耐藥株PC-9/AB11細胞以吉非替尼終濃度為0.05 μmol/L的培養基培養。細胞密度至80%時以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細胞形態學觀察 細胞培養至對數生長期，倒置相差顯微鏡（Nikon）下觀察細胞形態學的差異。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期 取同樣處于對數生長期的細胞約1×106個，PBS洗滌，離心，加入PI染色液，FACSAriaTM流式細胞儀（Becton Dickinson公司）檢測細胞周期。重復3次。

1.2.4 計數法繪制生長曲線 細胞鋪板接種數以7天-10天長滿為宜，共設10個點，每24 h計數1個點，每個點設3個重復。利用公式1[Td=T×lg2/lg(N/N0)，Td：倍增時間；T：間隔時間；N：終點細胞數；N0：起點細胞數]計算倍增時間。

1.2.5 MTT法測細胞耐藥指數 取狀態良好的處于對數生長期的細胞，用0.25%胰酶消化后制成細胞懸液，按每孔8×103個細胞，每孔體積100 μL，接種于96孔培養板中。培養24 h后，依次更換為吉非替尼終濃度為0 μmol/L、0.2 μmol/L、0.5 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的培養基，0 μmol/L為對照孔，不加細胞者為調零孔。每濃度設置6復孔。培養72 h后，向每孔加入新鮮MTT（5 mg/mL）20 μL，繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO，37 °C低速震蕩10 min，酶聯免疫檢測儀上測定490 nm波長各孔吸光值（D）。按公式2計算細胞生長抑制率，公式2：細胞生長抑制率=（D對照組-D實驗組）/D對照組×100%。繪制不同濃度下細胞生長抑制率曲線，并用Graphpad Prism 5.0軟件計算吉非替尼的半數抑制濃度（IC50）。實驗重復3次。

1.2.6 microRNA表達譜檢測 參照Affymetrix公司推薦方案用Trizol法提取總RNA，將制備好的RNA注入已備好的芯片，用1/2"Tough-Spots蓋上兩側隔片，將芯片放入雜交爐，48 °C，60 rpm孵育16 h，從雜交爐取出芯片，去掉Tough-Spots，提取hybridization cocktail移入新管，降至室溫后進行洗脫和染色。利用芯片掃描工作站3000系統（GeneChip 3000 7G，Affymetrix公司）掃描芯片。應用free miRNA QC Tool software初步分析結果。應用MiRNA QC Tool軟件進行數據分析，將芯片所有探針組的Signal從小到大排序，去掉最大的2%和最小的2%后，將剩下探針組的平均信號值調整到500。差異miRNA篩選標準：①信號ratio≥2為上調miRNA；②信號ratio≤0.5為下調miRNA。

1.2.7 Real-time PCR檢測 隨機選取表達具有明顯差異的microRNA進行real-time PCR實驗。設計待檢測microRNA引物，進行逆轉錄，將逆轉錄產物進行real-time PCR，分析結果。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0進行統計學分析，計量數據以Mean±SD表示，兩樣本均值比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖 1 PC9細胞（A）與PC9/AB11細胞（B）形態學比較Fig 1 The morphology between PC9 cell line (A) and PC9/AB11 cell line (B)

圖 2 PC9細胞與PC9/AB11細胞的細胞周期分布Fig 2 Comparison of the distribution of cell cycle between PC9 cell line and PC9/AB11 cell line

圖 3 PC9細胞與PC9/AB11細胞的生長曲線Fig 3 Growth curves between PC9 cell line and PC9/AB11 cell line

圖 4 不同濃度吉非替尼對PC9細胞和PC9/AB11細胞的抑制率Fig 4 The suppressive rates of Gefitinib on PC9 cell line and PC9/AB11 cell line at different concentrations of Gefitinib

2 結果

2.1 細胞形態學比較 在倒置相差顯微鏡低倍鏡下觀察，PC9呈不規則多角形，PC9/AB11呈梭形，細胞接觸抑制消失，有少量細胞堆積現象（圖1）。

2.2 細胞周期測定 PC9與PC9/AB11在G0/G1期分別為（52.14±0.95）%和（58.36±2.09）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）；S期分別為（43.24±0.74）%和（36.06±1.80）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）；G2/M期分別為（4.62±0.74）%和（5.58±0.33）%，兩組相比無統計學差異（P＞0.05）（圖2）。

2.3 繪制生長曲線并計算倍增時間 當細胞處于對數生長期時，計算細胞倍增時間，由公式1計算PC9和PC9/AB11的倍增時間分別是（25.80±1.59）h和（56.05±1.95）h，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4 吉非替尼對PC9及PC-9/AB11的IC50由公式2計算PC9和PC9/AB11細胞的抑制率，以吉非替尼濃度為因變量，以細胞抑制率為應變量，繪制兩種細胞的生長抑制曲線。通過Graphpad Prism 5.0軟件計算PC9和PC9/AB11細胞的IC50分別為（0.02±0.01）μmol/L和（2.07±0.11）μmol/L， 兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

2.5 MicroRNA芯片結果 將PC9細胞和PC9/AB11細胞分別進行microRNA芯片檢測，芯片雜交結果的掃描圖如圖5所示。芯片結果經數據處理和統計學分析，PC9細胞與PC9/AB11細胞共有13個microRNA的表達水平具有明顯性差異，PC9/AB11細胞相對于PC9細胞高表達的microRNA有4個，低表達的有9個。

2.6 Real-time PCR驗證結果 隨機抽取芯片結果中的miR-138進行real-time PCR驗證，引物設計如表1所示。real-time-PCR結果顯示，miR-138在PC9細胞中的2-△△Ct值為（1.005,0±0.086,3），PC9/AB11細胞中2-△△Ct值為（0.008,4±0.000,6），差異明顯（P＜0.05）（圖6）。與芯片結果一致。

圖 5 PC9細胞（A）與PC9/AB11細胞（B）microRNA芯片雜交圖Fig 5 PC9 cell line (A) and PC9/AB11 cell line (B) microarray scans

圖 6 MicroRNA-138在PC9和PC9/AB11中的表達比較Fig 6 Comparison of the expression level of microRNA-138 between PC9 cell line and PC9/AB11 cell line

表 1 逆轉錄及real-time PCR中microRNA-138引物序列Tab 1 The primer sequence of microRNA-138 in reverse transcription and real-time PCR

3 討論

吉非替尼是針對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的靶向治療藥物，對于EGFR突變和高拷貝EGFR基因的腫瘤具有較好的敏感性[8,9]，患者病情可以得到緩解甚至長期帶瘤生存，但是部分患者在經過3個月-7個月的緩解期后出現了病情進展[10]，繼續應用吉非替尼未能取得任何效果，此類患者出現了獲得性耐藥。研究[11]發現吉非替尼獲得性耐藥的產生是多種機制作用的結果。Kobayashi等[12]首次報道了EGFR基因外顯子20的C→T的點突變所導致第790位甲硫氨酸取代蘇氨酸（T790M）是導致吉非替尼耐藥的原因。此后，有多個研究小組[13,14]發現在發生獲得性耐藥的腫瘤內（具有L858R或delE746-A750突變）檢測到了T790M二次突變。這一現象表明，應用吉非替尼治療可能給予具有T790M突變的腫瘤細胞一種選擇性生長優勢，從而導致最終出現耐藥現象。EGFR信號通路與腫瘤耐藥有密切關系，Koizumi等[15]在PC-9及PC-9/ZD細胞中分析了EGFR及其銜接蛋白GRB2、SOS和Shc形成的復合物的差別。結果顯示，異常的銜接蛋白介導的EGFR到AKT的信號轉導可能是PC-9/ZD細胞中吉非替尼獲得性耐藥的一個機制。Uchida等[16]將致癌的K-Ras突變體轉染入吉非替尼敏感的細胞株內（PC-9和具有EGFR-L858R突變的293T細胞），驗證了下游信號通路中的突變導致的信號激活可以導致肺癌中吉非替尼獲得性耐藥。Jeffrey等[17]證實持續活化的PI3K/Akt信號通路在吉非替尼耐藥的過程中起到了一定的作用。PTEN的主要作用機制是Akt的去磷酸化作用，可以降低細胞內Akt的水平，發揮與PI-3K相反的作用。She等[18]發現PTEN的失活可以導致EGFR信號通路的異常，進而引起吉非替尼耐藥。

MicroRNA是一種內源性的非編碼的RNA序列，一般由21 nt-23 nt組成單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物體中[19]，在轉錄后水平負性調控基因的表達[20]。人們相繼發現microRNA參與人體多種生命活動，可以促進細胞增殖[21]，對細胞的凋亡通路進行調節[22]，參與細胞周期的調控[23]，參與人體的代謝過程[24,25]等。MicroRNA不僅參與細胞增殖、分化、凋亡、周期調控等，對腫瘤的化療耐藥也具有重要作用。Meng等[26]利用裸鼠構建膽管癌細胞移植瘤模型，在給予吉西他濱處理后有大量的microRNAs表達水平改變，證實microRNA可能參與了腫瘤細胞對化療藥物的反應。有研究[27]表明卵巢癌中高表達的miR-214可引起卵巢癌細胞對順鉑耐藥，Blower的研究組發現在多種腫瘤細胞中調節miR-21表達水平可導致藥物對細胞生長抑制效應的改變，miR-16也可以引起部分藥物-細胞對的藥效遷移[28,29]，表明MicroRNA是參與腫瘤化療藥耐藥的重要因子。microRNA可能也參與了腫瘤的吉非替尼獲得性耐藥。在乳腺癌細胞SKBr3中轉染miR-205的表達載體后，SKBr3細胞對吉非替尼的敏感度增加[25,30]。miR-128b可以靶向EGFR，在多例NSCLC腫瘤標本中可以檢測到miR-128b基因的雜合性缺失，并且miR-128b基因的雜合缺失與吉非替尼用藥后的臨床效果及生存明顯相關[31]。在肺癌細胞中過表達miR-let-7a、miR-126和miR-145能夠抑制AKT和ERK的活性，并增加肺癌細胞對吉非替尼的敏感度，轉染miR-126的表達載體后可使肺癌細胞的耐藥指數增加6倍[32]。

本實驗采用microRNA芯片對吉非替尼敏感株PC9細胞及由其衍生來的耐藥細胞株PC9/AB11細胞進行研究，在篩選出來的microRNAs中，多種microRNAs都參與調控細胞增殖、凋亡、周期及腫瘤細胞的侵襲、遷移等過程。MiR-138限制在特定的細胞類型中表達，而他的前體pre-miR-138-2廣泛的在所有組織中表達。pre-miR-138-2從細胞核進入細胞質，表明Dicer切割pre-microRNA的過程限制了一定的組織和細胞類型。因此，不同的premicroRNA可能是控制microRNA功能的機制之一[33]。miR-138在神經內管發育過程中，可能靶向于KDM6B的表達[34]；microRNA-138直接靶作用于EID-1的3'UTR區，負性調控機體的脂肪細胞生成過程[35]；還可以促進少突細胞的分化和髓鞘形成[36]；在先天無腦畸形的患兒組織里，miR-138明顯下調，可能與先天無腦畸形的形成有關[37]。MicroRNA可以在轉錄后的水平進行調節。Liu等[38]研究表明，miR-138在頭頸部腫瘤中可以抑制腫瘤侵襲促進凋亡；Mitomo[39]研究表明，miR-138可能通過作用于端粒酶逆轉錄酶參與了甲狀腺癌的發生。Zhao等[40]的研究證實miR-138也參與了腫瘤化療耐藥，miR-138可以顯著下調多重耐藥基因的表達，并逆轉白血病細胞株的多重耐藥。

本研究中，我們的實驗結果提示microRNA對肺腺癌細胞的吉非替尼獲得性耐藥的產生可能具有重要作用。在此研究基礎上我們將對microRNA對肺癌細胞的吉非替尼獲得性耐藥產生機制進行深入研究。本研究為全面、深入研究肺腺癌靶向治療耐藥的分子機制，篩選可預測肺腺癌靶向治療療效的microRNAs標志物提供了實驗基礎。