肺巖寧對人高轉移95-D肺癌細胞上皮-間質細胞標志因子表達的影響

趙曉珍 吳中華 徐振曄 王中奇 吳繼 蘇婉

腫瘤轉移的機理一直是腫瘤研究領域的熱點，而如何阻止與預防癌細胞的轉移更是研究者關注的焦點。上皮-間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮組織被各種刺激誘發(fā)的上皮細胞向間質細胞表型的轉化。在此過程中上皮細胞失去極性及細胞-細胞、細胞-基質間的粘附性，轉化為間質細胞，獲得遷移與侵襲能力；而在癌化過程中，癌細胞通過具有鋅指結構的Snail、Slug、Sip-1和具有螺旋-環(huán)狀-螺旋結構的Twist與E-Cadherin啟動子部分的E-boxes相結合，導致如上皮細胞標志因子E-Cadherin基因的失活和表達的下調，同時伴隨間質細胞標志因子Cadherin分子的轉化如N-Cadherin等。因此，EMT如果發(fā)生了就具備了轉移的特性，所以研究[1,2]認為EMT是導致癌細胞發(fā)生轉移的導火線。

肺巖寧方是徐振曄教授領導科研課題組在三十余年的臨床實踐中總結出以益氣養(yǎng)精、解毒抗癌為治法，防治肺癌轉移的中藥復方，在臨床上取得良好的抗腫瘤轉移的療效，使患者的生存期得到有效延長，生存質量明顯得到改善[3-5]。

本課題組在以往的研究中成功構建C57 Lewis肺轉移模型，實驗[6,7]結果提示肺巖寧方具有明顯上調上皮-間質細胞轉化過程中上皮細胞標志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin和下調間質細胞標志因子N-cadherin、Fibronectin的作用，說明在肺癌轉移的過程中伴隨著上皮-間質細胞表型的轉化，而肺巖寧方在一定程度上可以調控EMT過程的發(fā)生。本研究將以人高轉移肺癌細胞95-D作為研究對象，進一步研究肺巖寧方調控EMT的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑 人高轉移95D肺癌細胞，均由上海中科院細胞所提供。RPMI1640（GIBICO公司），新鮮小牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（華美生物制品公司），Trizol（Invitrogen公司），逆轉錄試劑（MBI公司），TaqDNA聚合酶及SYBR Green I熒光定量PCR試劑（大連寶生物工程公司），鼠抗人α-catenin抗體、鼠抗人β-catenin抗體、鼠抗人E-Cadherin抗體、鼠抗人Vimentin抗體、鼠抗人Fibronectin抗體、鼠抗人N-cadherin抗體均購買于Santa cruz。

1.2 藥物 肺巖寧方：由生黃芪、女貞子、蜂房、山慈菇、七葉一枝花、黃精等藥物組成。龍華醫(yī)院中藥房提供；順鉑（DDP）：20 mg/瓶，齊魯制藥廠產品，批號：0501003。

1.3 細胞培養(yǎng) 將人高轉移95D細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中（pH7.2-7.4），在37oC、5%CO2和飽和濕度條件下，細胞呈貼壁生長，待其鋪滿瓶時以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4 肺巖寧方含藥血清的制備 雄性SD大鼠10只，隨機分為對照組和肺巖寧方組，每組5只，組間體重差異無統(tǒng)計學意義，肺巖寧方組按體重灌胃給予肺巖寧方藥液（相對于人臨床用藥劑量的8倍），對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，2次/d，共3 d，最后一次給藥前禁食12 h（不禁水）。末次給藥后1 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉5 mL麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，立即注入無菌試管中，室溫靜置，待凝血堅固，血清析出后，吸出上清離心處理（3,000 r/min，10 min，離心半徑為10 cm），取上清3 mL左右，同組血清混合，置于無菌試管中，56oC水浴中滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜除菌，分裝，密封，-20oC冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實驗分組 將細胞密度調至1×106個/mL后均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，6個復孔，置入37oC、5%CO2含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，待細胞生長旺盛時，離心去掉上清液，分別加入各組不同濃度的細胞培養(yǎng)液，根據預實驗依據含藥血清濃度由低到高分為5組，使其終濃度為體積分數(shù)5%、 10%、15%、20%、25%，另設對照組DDP化療陽性對照組（2 μg/mL）和15%空白血清對照組，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞檢測。

1.6 Real-time PCR檢測各組細胞α-catenin、β-catenin、E-Cadherin、N-cadherin、Fibronectin、Vimentin RNA表達按照說明用Trizol等試劑從細胞中提取總RNA，以75%乙醇洗滌后再用DEPC處理水溶解RNA的制備：取各組的對數(shù)生長期細胞1×107個，加入1 mL Trizol勻漿后按照說明書提取總RNA，1 μL總RNA在20 μL體系中按照標準程序進行逆轉錄，逆轉錄酶采用M-MuLV。各基因mRNA拷貝數(shù)檢測采用實時定量PCR，反應體積為20 μL，其中含終濃度為200 nmol/L的上下游引物和2×的熒光標記物SYBRGreen PCR Master Mix，擴增反應用SYBR Green I定量PCR試劑盒，各反應管放入ABI-7300定量PCR儀。內參選用GAPDH引物由上海Invitrogen公司設計合成。引物序列見表1。

1.7 Western blot方法檢測各組細胞α-catenin、β-catenin、E-Cadherin、 N-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白表達提取適量細胞中加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提試劑，輕輕搖動5 min。轉移細胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動15 min進行裂解。上清液采用BCA蛋白定量，取蛋白進行SDS-PAGE電泳膠分離后轉移到PVDF膜，膜封閉后加入多克隆抗體4oC過夜，然后加入相應二抗后膜在將膜置于反應液中室溫孵育5 min。去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件，并用分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。

1.8 數(shù)據處理統(tǒng)計分析 基因表達采用2-△△ct法對實驗樣品進行相對定量。實驗數(shù)據以Mean±SD表示，根據數(shù)據類型選擇重復測量設計方差分析或單因素方差分析的統(tǒng)計方法，采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。以P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

表 1 各基因PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of different gene

2 結果

2.1 肺巖寧處理后人肺高轉移95-D細胞上皮細胞標志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin基因表達的影響與對照組相比，20%肺巖寧處理組α-catenin表達上調（P＜0.05），20%、25%肺巖寧處理組E-Cadherin表達上調（P＜0.05, P＜0.01），而各肺巖寧處理組β-catenin的表達無明顯差異，陽性對照DDP組β-catenin表達上調（P＜0.01）（圖1）。

2.2 肺巖寧處理后人肺高轉移95-D細胞上皮細胞標志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin蛋白表達的影響 與對照組相比，5%、10%、15%、20%肺巖寧處理組E-Cadherin表達上調（P＜0.01），而各肺巖寧處理組α-catenin、β-catenin的表達無明顯差異（圖2）。

2.3 肺巖寧處理后人肺高轉移95-D細胞間質細胞標志因子N-cadherin、Fibronectin、Vimentin基因表達的影響 與對照組相比，5%、10%肺巖寧處理組Vimentin表達下調（P＜0.01），而各肺巖寧處理組N-cadherin、Fibronectin的表達無明顯差異（圖3）。

2.4 肺巖寧處理后人肺高轉移95-D細胞間質細胞標志因子N-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白表達的影響 與對照組相比，5%、10%肺巖寧處理組N-cadherin、Fibronectin表達下調（P＜0.01），而各肺巖寧處理組Vimentin的表達無明顯差異（圖4）。

圖 1 不同組別上皮細胞標志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin基因表達變化。直方圖顯示20%肺巖寧處理組α-catenin表達增加，20%、25%肺巖寧處理組E-Cadherin表達增加，DDP處理組β-catenin表達增加。Fig 1 The gene expression of epithelial cell markers α-catenin,β-catenin, E-Cadherin in different groups. The relative experssion of α-catenin mRNA was increased in 20% Feiyanning treated group;E-Cadherin mRNA were increased in 20% and 25% Feiyanning treated groups; β-catenin mRNA was increased in DDP chemotherapy group.

圖 2 不同組別上皮細胞標志因子β-catenin、α-catenin、E-Cadherin蛋白表達變化。A：以actin為內參照，上皮細胞標志因子蛋白電泳圖；B：直方圖顯示5%、10%、15%、20%肺巖寧處理組E-Cadherin蛋白表達增加，各肺巖寧處理組中α-catenin、β-catenin表達無差別。Fig 2 The relative expression ofβ-catenin, α-catenin, E-Cadherin protein in different groups. A: actin as an internal reference, the figure of protein electrophoresis to the epithelial cell marker factor; B: The relative expressionof E-Cadherin protein were increased in 5%, 10%, 15%, 20% Feiyanning treated groups, and there was no difference for α-catenin, β-catenin in Feiyanning treated groups.

圖 3 不同組別間質細胞標志因子N-cadherin、Fibronectin、Vimentin基因表達變化。直方圖顯示5%、10%肺巖寧處理組Vimentin表達降低，各肺巖寧處理組中N-cadherin、Fibronectin表達無明顯變化。Fig 3 The gene expression of mesenchymal cell markers of N-cadherin,Fibronectin, Vimentin in different groups. The relative experssion of Vimentin mRNA were decreased in 5% and 10% Feiyanning treated groups, but there was no difference for N-cadherin and Fibronectin in Feiyanning treated groups.

圖 4 不同組別間質細胞標志因子N-cadherin、Fibronectin、蛋白表達變化。A：以actin為內參照，間質細胞標志因子蛋白電泳圖；B：直方圖顯示5%、10%肺巖寧處理組N-cadherin、Fibronectin蛋白表達下降，各肺巖寧處理組中Vimentin表達無明顯變化。Fig 4 The relative expression of N-cadherin, Fibronectin, Vimentin protein in different groups. A: actin as an internal reference, the figure of protein electrophoresis to the mesenchymal cell markers factor; B: The relative expression of N-cadherin and Fibronectin protein were deceased in 5% and 10% Feiyanning treated groups, but there was no difference for Vimentin in Feiyanning treated groups.

3 討論

醫(yī)學研究[8]表明，腫瘤的轉移是導致死亡和手術失敗的主要原因。所以明確腫瘤轉移的機理及進一步研究抗腫瘤轉移的藥物成為癌癥研究領域的熱點。中醫(yī)藥抗腫瘤的研究主要方向之一即在于中藥方劑對腫瘤轉移的抑制上，我們課題組三十余年臨床探索認為精氣兩虧是導致腫瘤轉移的重要因素之一，采用益氣養(yǎng)精為主要治則的肺巖寧方即是在此理論指導下產生并被實踐證明有效的方劑。

EMT是指從具有極性的上皮細胞轉換成具有移行能力的間質細胞的一個過程。研究[9,10]發(fā)現(xiàn)其不僅參與了胚胎的發(fā)育、組織的形成，而且參與了腫瘤細胞轉移的發(fā)生。

EMT發(fā)生過程中的重要性標志就是E-Cadherin表達的減少和缺失。E-Cadherin是鈣粘蛋白家族的一個成員，它在維持上皮細胞的極性及增強細胞間的粘附中具有重要作用，它表達的減少可以導致細胞極性的消失和細胞粘附能力的下降，在多項研究[10-16]中已經證實E-Cadherin的表達與腫瘤的侵襲能力成負相關，上皮細胞極性消失的同時伴隨著間質細胞標志因子Vimentin、N-cadherin、Fibronectin等表達的增加，從而促使EMT過程的發(fā)生，導致腫瘤轉移的開始。

本實驗結果表明：以人肺癌高轉移95-D細胞為研究對象，和正常血清對照組相比，肺巖寧在mRNA和蛋白質水平具有上調上皮細胞標志因子E-Cadherin的作用；在mRNA水平具有下調間質細胞標志因子Vimentin的作用；在蛋白質水平具有下調N-cadherin、Fibronectin的作用，而對上皮細胞標志因子α-catenin、β-catenin卻無調控作用。由此我們認為：①人高轉移肺癌95-D細胞轉移過程的發(fā)生中伴隨著EMT標志因子表達的改變；②中藥復方肺巖寧通過上調E-Cadherin、下調Vimentin、N-cadherin、Fibronectin的表達而達到抑制腫瘤轉移的作用；③mRNA水平和蛋白質水平肺巖寧調控的標志因子存在差異；④肺巖寧方調控EMT過程的發(fā)生是多靶點的、多層次的。

因此，我們將在今后的研究中一方面圍繞調控EMT的信號途徑闡釋復方肺巖寧方抗腫瘤轉移的機理，另一方面以Vimentin為例，深入探討肺巖寧方在轉錄和蛋白質水平調控機制存在差異的原因。進一步揭示中醫(yī)藥抗腫瘤轉移的機理。