整合素α5β1介導細胞外信號調節激酶信號轉導通路對A549細胞生長和侵襲的影響

白晶 鐘小寧 唐海娟 何志義 張建全 鄧靜敏

整合素（integrin）是細胞粘附分子中一類重要的細胞表面受體家族，由α和β兩個亞基組成的跨膜異二聚體，α和β亞基均由長的胞外區、跨膜區和短的胞內區組成，主要介導信息從細胞外基質向細胞內傳遞，調控細胞與胞外基質的粘附和細胞間的粘附，并參與調控細胞的增殖、分化、伸展與遷移等[1]。因此整合素的信息傳遞在促進腫瘤細胞失控制性生長、腫瘤細胞的去分化與遠處轉移發揮重要作用[2]。但是，對于整合素的細胞內外信號傳導的具體過程及眾多整合素相關蛋白的功能目前仍不十分清楚。整合素α5β1是整合素分子家族中重要的亞單位，能與不同的亞單位結合，構成細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的絕大多數受體。近年研究[3,4]顯示整合素α5β1的高表達與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的轉移性、浸潤性和低分化趨向密切相關，是NSCLC患者預后不良的危險因素。細胞外信號調節激酶（extracelluar signal-regulated protein kinase,ERK）通路是細胞內重要的信號轉導系統，可將胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，介導細胞生物學反應（如增殖、分化、轉化及凋亡等）的過程，與腫瘤的發生發展密切相關[5]。整合素α5β1是否通過ERK1/2信號通路調控了肺癌細胞發生發展過程，目前尚無相關研究報道。本實驗應用整合素α5/β1 siRNA雙鏈及ERK抑制劑PD98095干預人肺癌細胞A549，旨在研究整合素α5β1蛋白表達對A549細胞生長和遷移能力的影響及其細胞內機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肺癌細胞株A549由華中科技大學附屬同濟醫院呼吸內科重點實驗室贈送。RPMI-1640培養基購自Hyclone公司，OligofectamineTM和Opti-MEMI購自Carlsbad公司， 整合素α5/β1小片段干擾核糖核酸（small interfering RNA, siRNA）雙鏈、兔抗人整合素α5、β1單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，新生牛血清和Trizol試劑盒購自Gibco公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司，碘化丙錠（propidium iodide, PI）購自Sigma公司，二甲基亞砜及噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT）均購自Clontech公司，ERK抑制劑（PD98095）購自美國CST公司，兔抗人磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）單克隆抗體、小鼠抗人ERK1/2單克隆抗體，小鼠抗人基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotease, MMP）-9單克隆抗體，兔抗人半胱天冬酶（caspase）-3單克隆抗體購自美國R＆D公司。TaqDNA聚合酶、莫洛尼(氏)鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus, M-MLV）、寡脫氧胸苷酸、核糖核酸酶抑制劑及瓊脂糖均購自美國Promega公司，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）試劑盒，整合素α5、整合素β1及內參磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）引物購自日本Takara公司，增強型ECL化學發光檢測試劑盒購自美國Plierce公司。PCR和蛋白質印跡（Western blot）圖像由Bio-Rad公司Gel Doc XR凝膠成像系統掃描，圖像分析用Quantity One（version 4.6）分析軟件完成。

1.2 細胞培養、分組 A549細胞用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基，于37oC、5%CO2培養箱內培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。用瞬時轉染方法特異性抑制整合素α5β1表達。利用ERK抑制劑PD98059抑制ERK的磷酸化。取對數生長期A549細胞接種，待細胞融合度達95%時，進行干預。將細胞分為4組：①未轉染組：A549細胞不加任何干預；②脂質體組：A549細胞與Oligofectamine脂質體按比例混合；③整合素α5/β1 siRNA轉染組：整合素α5和β1 siRNA與Oligofectamine脂質體按比例混合經Opti-MEMI稀釋，加入培養好的細胞中，轉染步驟按Santa Cruz公司說明書進行。轉染培養6 h后，在熒光顯微鏡下觀察，可見熒光素異硫氰酸酯（FITC）標記的siRNA轉染的細胞轉染成功。然后改為10%血清的RPMI-1640培養基繼續培養18 h后應用RT-PCR和Werstern blot法檢測RNA干擾效果；④PD98059組：A549細胞加入PD98059 10 μmol/L培養24 h。每組設4個復孔。

1.3 RT-PCR和Werstern blot法檢測A549細胞中整合素α5β1蛋白和mRNA表達 轉染24 h后分別提取總RNA、總蛋白。

首先將RNA逆轉錄成cDNA，隨后PCR擴增。整合素α5基因片段，上游引物序列為5′-TCTGCCTCAATG CTTCTGG-3′，下游引物序列為5′-GTTGAGAGCGATG TGAATCG-3′，擴增片段248 bp。整合素β1基因片段，上游引物序列為5′-ACACGTCTCTCTCTGTCG-3′，下游引物序列為5′-CAGTTGTTACGGCACTCT-3′，擴增片段158 bp。GAPDH作為內參照，上游引物序列為：5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物序列為：5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'，擴增產物片段376 bp。PCR反應條件設置如下：94oC預變性2 min，94oC變性60 s，58oC退火45 s，72oC延伸1 min，35個循環。各取5 μL PCR產物與2 μL溴酚藍混合后上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。紫外光下觀察并照相，采用軟件分析目的基因和GAPDH條帶的光密度（A）值，以同一管中目的基因和GAPDH產物條帶A值之比作為反映目的基因mRNA表達水平的數據。

提取細胞總蛋白質后，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度以保證每個上樣孔總蛋白量一致。蛋白變性、上樣，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉膜，孵育一抗（稀釋比例1:1,000）、二抗（稀釋比例1:2,000），ECL發光，膠片曝光。以β-actin作為內參照。膠片掃描并照相，測定各條帶灰度值。以目的蛋白和β-actin條帶A值之比作為反映目的蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.4 Western blot檢測轉染對ERK1/2蛋白表達的影響 收集細胞，采用Western blot檢測ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達，一抗ERK1/2、p-ERK1/2按1:1,000稀釋，方法同前。曝光后X光片用凝膠圖像分析軟件掃描，測定蛋白條帶的灰度值。結果均用實際值與內參β-actin的比值（A%）表示，并計算ERK磷酸化，即p-ERK1/2蛋白占ERK1/2蛋白表達的百分率（%）。每組重復實驗3次。

1.5 MTT法檢測細胞增殖 96孔板內的A549培養結束4 h前，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），培養4 h后去培養液，加入150 μL二甲基亞砜充分溶解結晶物，采用酶標儀檢測490 nm處吸光度A值。

1.6 Annexin-V FITC PI雙染色法檢測細胞凋亡 收集細胞，磷酸鹽緩沖液漂洗兩次，加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫作用15 min，于流式細胞儀檢測早期凋亡細胞百分率（Annexin V-FITC陽性，PI陰性）。

1.7 Western blot檢測A549細胞中caspase-3、 MMP-9蛋白的表達 每孔取20 μg總蛋白加入等體積的上樣緩沖液，煮沸變性10 min后，進行制膠、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，泳閉，經電轉印將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，封閉后，加入一抗（caspase-3、 MMP-9均按1:1,000稀釋），4oC孵育過夜，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記二抗（1:2,000稀釋），室溫搖床上孵育2 h，充分漂洗后按ECL發光試劑盒說明書操作，曝光后X光片用凝膠圖像分析軟件掃描，測定蛋白條帶的灰度值。結果均用實際值與內參β-actin的比值（A%）表示。實驗重復3次。

1.8 統計學分析 數據使用SPSS 12.0統計軟件分析，所有數值以Mean±SD表示。組間數據比較采用單因素方差分析，任意兩組均數之間的比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 整合素α5β1 siRNA導入細胞的證實 經FITC標記的整合素α5β1 siRNA與A549共培養6 h后，細胞質、細胞核均有染色，部分細胞核核仁染色突出，有明亮的熒光（圖1）。

2.2 轉染后A549細胞中整合素α5β1蛋白和mRNA表達受抑制 如圖2所示，以β-actin為內參測定各組灰度比值，與脂質體組整合素α5蛋白（0.891±0.063）、整合素β1蛋白（0.963±0.082）比較，轉染后整合素α5、β1蛋白表達（分別為0.227±0.071、0.375±0.028）明顯降低。脂質體組與未轉染組相比差異無統計學意義（P＞0.05），提示整合素α5/β1 siRNA雙鏈轉染24 h后對整合素α5β1蛋白表達有抑制作用。采用RT-PCR檢測是否在整合素α5β1蛋白明顯降低的同時伴有整合素α5β1 mRNA的表達變化。整合素α5β1 mRNA的表達與整合素α5β1蛋白表達具有相似的趨勢，與脂質體組整合素α5 mRNA（0.78±0.12）、整合素β1 mRNA（0.56±0.09）比較，轉染組整合素α5 mRNA、β1 mRNA（分別為0.29±0.03、0.17±0.02）表達均明顯降低。脂質體組與未轉染組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染對各組細胞中β-actin的蛋白及GAPDH的mRNA表達無任何影響。干擾具有特異性。

2.3 轉染后A549細胞中ERK磷酸化受抑制 與脂質體組（分別為0.272±0.015、0.217±0.006）比較，轉染整合素α5/β1 siRNA雙鏈24 h后ERK1/2蛋白（0.089±0.017）和p-ERK1/2蛋白（0.042±0.017）表達水平均明顯降低，ERK磷酸化水平降低（30.96±3.07）%。脂質體組與未轉染組相比差異無統計學意義，提示抑制整合素α5/β1蛋白和mRNA表達的同時可以明顯降低ERK磷酸化，提示整合素α5/β1與ERK1/2信號通路之間具有密切關系（圖3）。

2.4 整合素α5/β1介導ERK1/2信號通路抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡 與未轉染組和脂質體組比較，轉染整合素α5/β1 siRNA雙鏈24 h后A549細胞增殖受到抑制，差異有統計學意義（P＜0.01），而在未轉染組和脂質體組A549細胞增殖差異無統計學意義。未轉染組中細胞增殖可以被ERK抑制劑PD98059所抑制。與未轉染組和脂質體組比較，轉染整合素α5/β1 siRNA雙鏈24 h后A549早期凋亡細胞百分率明顯增高，而在未轉染組和脂質體組A549早期凋亡細胞百分率差異無統計學意義。未轉染組中早期凋亡細胞百分率同樣可以被ERK抑制劑PD98059所提高，提示整合素α5/β1可能介導ERK1/2信號通路抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡（表1）。

2.5 整合素α5/β1介導ERK1/2信號通路促進caspase-3表達增強 如圖4所示，轉染后caspase-3蛋白（1.671±0.027）表達增高，而未轉染組（0.869±0.022）和脂質體組（0.851±0.067）比較差異無統計學意義。PD98059組caspase-3蛋白（1.604±0.011）表達也增高。

圖 1 轉染后A549細胞（A：相差顯維鏡，×200；B：熒光顯維鏡，×200）。Fig 1 A549 cells were transfected and watched (A: phase contrast microscopy, magnification ×200; B: microscopy,magnification ×200).

圖 2 整合素α5/β1 siRNA抑制A549細胞中整合素α5β1蛋白和mRNA的表達（1.未轉染組；2.脂質體組；3.整合素α5/β1 siRNA轉染組）。A：A549細胞中整合素α5β1的Western blot檢測結果，以β-actin作為內參；B：柱狀分析圖，結果顯示整合素α5/β1 siRNA抑制整合素α5β1的蛋白表達；C：A549細胞中整合素α5β1的RT-PCR檢測結果，以GAPDH作為內參；D：柱狀分析圖，結果顯示整合素α5/β1 siRNA抑制整合素α5β1 mRNA表達。* P＜0.05.Fig 2 The inhibition of integrin α5β1 protein and mRNA in A549 by integrin α5β1 small interfering RNA (1. Untransfection group; 2.Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group). A: The expression of integrin α5β1 protein in A549 detected by Western blot,β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis of integrin α5β1 shows the integrin α5β1 small interfering RNA suppressed the expression of integrin α5β1 protein; C: The expression of integrin α5β1 mRNA in A549 detected by RT-PCR, GAPDH served as internal control; D:The densitometric analysis of integrin α5β1 shows the integrin α5β1 small interfering RNA suppressed the expression of integrin α5β1 mRNA.* P＜0.05.

圖 3 整合素α5/β1 siRNA抑制A549細胞中ERK磷酸化（1.未轉染組；2.脂質體組；3.整合素α5/β1 siRNA轉染組）。A：A549細胞中ERK1/2和p-ERK1/2的Western blot檢測結果，以β-actin作為內參；B：柱狀分析圖，結果顯示整合素α5/β1 siRNA可以通過抑制ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達來抑制ERK磷酸化。* P＜0.05。Fig 3 The inhibition of the phosphorylated ratio of ERK in A549 by integrin α5β1 small interfering RNA (1. Untransfection group; 2. Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group). A: The expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in A549 detected by Western blot, β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis shows the integrin α5β1 small interfering RNA could suppress the phosphorylated ratio of ERK by down-regulating the expression of ERK 1/2 and p-ERK1/2 proteins. * P＜0.05.

圖 4 整合素α5/β1 siRNA對A549細胞中caspase-3表達的影響（1.未轉染組；2.脂質體組；3. 整合素α5/β1 siRNA轉染組；4. PD98059組）。A：A549細胞中caspase-3的Western blot檢測結果，以β-actin作為內參；B：柱狀分析圖，結果顯示整合素α5/β1 siRNA促進caspase-3蛋白表達。* P＜0.05。Fig 4 Effect of integrin α5β1 small interfering RNA on caspase-3 protein in A549. (1. Untransfection group; 2. Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group; 4. PD98059 group). A: The expression of caspase-3 in A549 detected by Western blot, β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis of caspase-3 shows the integrin α5β1 small interfering RNA could up-regulate the expression of caspase-3. * P＜0.05.

表 1 整合素α5/β1 siRNA對A549細胞增殖和凋亡的影響Tab 1 Effect of integrin α5β1 small interfering RNA on the proliferation and apoptosis of A549 cells

2.6 整合素α5/β1介導ERK1/2信號通路抑制MMP-9蛋白的表達 如圖5所示，轉染后MMP-9蛋白（0.207±0.020）表達下降，而未轉染組（0.912±0.041）和脂質體組（0.920±0.087）比較差異無統計學意義。PD98059組MMP-9蛋白（0.186±0.033）表達也降低。

圖 5 整合素α5/β1 siRNA對A549細胞中MMP-9蛋白表達的影響（1. 未轉染組；2. 脂質體組；3. 整合素α5/β1 siRNA轉染組；4. PD98059組）。A：A549細胞中MMP-9的Western blot檢測結果，以β-actin作為內參；B：柱狀分析圖，結果顯示整合素α5/β1 siRNA抑制MMP-9蛋白表達。* P＜0.05.Fig 5 Effect of integrin α5β1 small interfering RNA on MMP-9 protein in A549 (1. Untransfection group; 2. Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group; 4. PD98059 group ). A: The expression of MMP-9 in A549 detected by Western blot, β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis of MMP-9 shows the integrin α5β1 small interfering RNA could suppress the expression of MMP-9.* P＜0.05.

3 討論

整合素是由α和β兩條鏈以共價鍵連接構成的細胞表面受體家族，以異二聚體的形式表達于細胞表面.不僅可以通過識別細胞外基質的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）序列介導細胞與細胞外基質之間的粘附，與免疫球蛋白超家族分子結合介導細胞與細胞間的粘附，還可以雙向轉導細胞內外的信號，直接影響細胞的生存、生長、增殖、分化以及腫瘤細胞的侵襲和轉移等生物學行為。

Adachi等[3]的研究顯示NSCLC組織中整合素α5β1的高表達與腫瘤分級負相關，低分化NSCLC中的整合素α5β1表達明顯高于高分化NSCLC，且整合素α5β1高表達者的生存期明顯低于表達正常者。Oshita等[4]的研究也表明在NSCLC組織中，整合素α5β1和p53是影響預后的最主要危險因素。因此，整合素α5β1的高表達可能在NSCLC生長、增殖、凋亡和轉移的調控中起到重要作用。本組研究結果表明，轉染整合素α5/β1 siRNA雙鏈后A549細胞增殖受到抑制，早期凋亡百分率增加，MMP-9蛋白表達下降提示整合素α5β1參與調控肺癌A549細胞凋亡、增殖、侵襲和轉移，整合素α5/β1 siRNA雙鏈通過抑制整合素α5/β1蛋白和mRNA表達抑制肺癌A549細胞生長和遷移。

廣泛存在于腫瘤細胞表面的整合素受體及其引發的異常信號轉導機制在腫瘤的轉移、浸潤及細胞的增殖和凋亡中起著重要作用[6,7]。以整合素為靶點的藥物也正在進行[8]。整合素α5β1是整合素分子家族中重要的亞單位，在肺癌細胞的去分化與遠處轉移中發揮重要作用[9]。然而在整合素活性調節機制中，還有很多沒有闡明的問題，如整合素介導的由外而內的信號傳遞和由內而外的信號傳遞之間有什么相互關系？細胞通過哪些通路和分子來實現對整合素活性的調控？為此，我們選用整合素α5/β1 siRNA雙鏈和ERK抑制劑PD98095干預人肺癌細胞A549，旨在探討整合素α5/β1是否介導了ERK1/2信號通路影響A549細胞生長和遷移。研究顯示，轉染整合素α5/β1 siRNA雙鏈后A549細胞的ERK磷酸化明顯受到抑制，提示整合素α5β1與ERK1/2 信號通路密切相關，進一步研究顯示ERK抑制劑PD98059同樣能抑制A549細胞增殖，促進早期凋亡和抑制MMP-9蛋白表達，提示ERK1/2信號通路同樣參與調控了肺癌A549細胞凋亡、增殖、侵襲轉移，整合素α5β1可能介導ERK1/2信號通路調控A549細胞的生長與遷移。國外研究[10,11]顯示整合素α5β1的高表達狀態與慢性髓細胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）的發病息息相關，通過FAK-MAPK或PI3K-AKT信號途徑上調核內某些基因的表達，促使細胞發生白血病轉化、異常增殖和凋亡受抑。有研究[9,12]顯示整合素β1通過ERK1/2信號通路上游的FAK調控肺癌細胞的增殖。α-倒捻子素可以抑制由佛波酯誘導活化的整合素α3后通過FAK-ERK-NF-κB信號途徑調控MMP-2和MMP-9的表達，從而抑制A549細胞遷移[13]。骨橋蛋白可以識別整合素αvβ3，啟動FAK-PI3K-ERK細胞內信號通路，促進A549細胞的遷移[14]。因此，ERK1/2信號通路在調控A549細胞的生長、增殖、凋亡和轉移中具有重要作用，阻斷這些信號通路上游的整合素，其介導的生長、增殖、凋亡和轉移必然受到影響。

此外，我們同時亦發現整合素α5/β1 siRNA雙鏈及ERK抑制劑PD98059均可以使A549細胞中caspase-3表達增高，提示整合素α5β1可能介導了ERK1/2信號通路誘導caspase-3表達增高，從而促使凋亡的發生，阻斷整合素α5β1有可能防止細胞惡性轉化、腫瘤侵襲轉移以及耐藥的發生。已有研究[15]顯示整合素α5β1拮抗劑在膠質母細胞瘤細胞實驗治療中有明顯促進細胞凋亡、誘導細胞老化的作用。

總之，我們的研究證實，在A549細胞中整合素α5β1可能通過誘導ERK的磷酸化，進而抑制caspase-3蛋白和促進MMP-9蛋白的表達，從而發揮調控細胞的生長與遷移作用。本研究揭示了整合素α5β1在A549細胞中的作用及相關細胞內信號調節機制，為以整合素為靶點的肺癌分子治療提供了實驗基礎和理論依據。