EML4-ALK與EGFR基因突變共存型非小細胞肺癌研究進展

曾珠 吳一龍

肺癌是美國病死率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%-85%，其傳統治療方法包括化療、放療、手術等。隨著腫瘤發病機制研究的不斷深入，分子靶向治療已經成為了研發熱點，并初步取得了療效。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、棘皮動物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule associated protein like4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）等靶點的分子抑制劑在臨床上的成功讓學者們將更多的精力投入到分子靶向的研究中。2011年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）大會提示腫瘤診療已經進入分子靶向治療的時代。既往研究[2-4]認為NSCLC中EML4-ALK融合基因與EGFR及KRAS（Kirsten Ras）突變是相互排斥的。近期陸續發現有EML4-ALK融合基因和EGFR突變共存的案例。在強調個體化治療的時代，這部分患者的臨床表現特點和治療方法值得研究，本文就這些問題進行綜述。

1 EML4-ALK融合基因的分子結構和在NSCLC中的發生率

間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）是一個由細胞外配體結合區、跨膜區及胞內的酪氨酸激酶區組成的1,620個氨基酸的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族[5]。

棘皮動物微管相關樣蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4）屬于棘皮動物微管相關樣蛋白家族，由N末端堿基區（N-terminal basic region）、疏水的棘皮動物微管相關蛋白（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein, HELP）區以及WD重復區（WD-repeat region）3 部分構成。WD重復區是一段通常以色氨酸-天冬氨酸結尾的氨基酸的序列，包含了4個-16個重復的單元，其所有的單元一起形成一個beta螺旋結構。WD重復區作為一個大家族廣泛存在于真核生物中，負責細胞信號轉導、細胞周期控制、細胞凋亡調控等。研究[2]證明在EML4-ALK融合基因中，以上3個部分都與腫瘤的形成有關，其中N末端堿基區的作用最為重要。

EML4-ALK融合基因是由日本學者Soda等在1名62歲有吸煙史的男性腺癌患者的腫瘤組織中首次發現的。基因的重排發生在2號染色體短臂上的2區1帶和2區3帶，由ALK基因的3′端與EML4基因的5′倒位融合形成。EML4基因斷裂后形成不同長度的外顯子拼接片段，插入位置相對保守的ALK基因的19號、20號外顯子之間，從而形成有11個變體的EML4-ALK融合蛋白[2,3,6-11]。融合基因大多都有致瘤性[12]，其中變體1最常見，變體3a/3b次之[13]。以最常見的變體1為例，EML4在WD重復區處斷裂，形成一個由N末端堿基區、HELP區、部分WD重復區組成的片段與ALK的胞內區融合[2]。融合基因中EML4的啟動子位于ALK胞內酪氨酸激酶的上游，從而導致融合基因活化，表達EML4-ALK融合蛋白。通過EML4的胞外結構形成的二聚體使ALK在缺乏配體的情況下受體持續自磷酸化，進而持續激活下游細胞信號通路導致細胞惡性轉化[14]。

文獻[15]報道不加選擇的NSCLC患者EML4-ALK融合基因總發生率為3.4%（范圍0.4%-11.6%）。東方人群NSCLC患者的總發生率為4.1%，歐美人群為2.5%。Shaw等[9]在女性、亞裔、不吸煙或者是輕度吸煙（每年吸煙≤10包或戒煙≥1年者）這4個條件至少滿足2個條件的141名肺腺癌患者的腫瘤組織中用熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization, FISH技術）檢測了EML4-ALK融合基因的發生率，結果顯示其發生率高達13%；在EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者則為33%。Zhang等[4]用RACE-coupled PCR sequencing法在中國NSCLC患者中進行檢測，結果表明中國的非選擇性NSCLC患者中該融合基因的發生率為11.6%，EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者高達42.8%。

2 EGFR突變基因的分子結構及發生率

EGFR具有受體酪氨酸激酶活性，屬于I型生長因子受體家族，由1個胞外配體結合區、跨膜區和1個胞內區構成。EGFR與配體結合后形成同源或異源二聚體，引起構象變化，激活下游的多個信號通路，在腫瘤發生與轉移的多個環節中起調節作用。

EGFR基因位于7號染色體短臂的12-14區，由28個外顯子組成，突變多位于19-21外顯子（酪氨酸激酶功能區），其突變主要有3種類型：①19外顯子堿基缺失，改變了受體ATP結合囊（ATP-binding pocket, ABP）角度，增強了腫瘤細胞對酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）的敏感性[16,17]，Shigematsu等[18]發現19外顯子突變的發生率最高，占EGFR突變總數的50%以上；②20外顯子點突變或堿基插入突變，20外顯子的點突變主要是第790位密碼子出現C-T轉換，從而引起該處的蘇氨酸轉變為甲硫氨酸（T790M），這一突變多見于藥物治療后的復發患者，突變后腫瘤細胞對TKIs產生抵抗[19]。插入突變出現在第770-775位密碼子，插入一個長約3個-9個堿基的片段，約5%的NSCLC患者出現插入突變。體外實驗表明，與19及21外顯子突變相比，20外顯子插入突變的患者對EGFR-TKIs不敏感并且大多數出現疾病進展[20]；③21外顯子點突變，主要是851位密碼子出現T-G轉換，亮氨酸轉變為精氨酸（L858R），突變提高了腫瘤細胞對TKIs的敏感性[17]。

在非選擇性NSCLC患者中，EGFR在美國的NSCLC腺癌患者中突變率約為15%[21]；在亞裔人群為30%-50%，且大部分是腺癌和支氣管肺泡癌[22]。

3 EGFR-TKIs、ALK-TKIs靶向治療的療效

ALK的口服抑制劑PF-02341066（Crizotinib）的I期臨床試驗（NCT00585195或A8081001）開始于2006年。2009年ASCO年會上報道，PF-02341066的有效率達53%（10/19），疾病控制率達到79%（12/19）。鑒于良好的安全性和較高有效率，美國食品及藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準此藥直接進入III期臨床試驗。目前該藥的全球III期臨床試驗正在進行中。2011年ASCO對Crizotinib的I期臨床試驗結果進行了更新，入組NSCLC患者已達119例，中位無進展生存期達到10個月（95%CI： 8.2-14.7），客觀有效率為61%（95%CI：52%-70%）。中位有效應答時間為48 w，中位生存時間達1年的概率為81%[23]。

與EGFR-TKIs及其它酪氨酸激酶抑制劑一樣，即使在治療初期Crizotinib能取得明顯的療效，腫瘤最終也會對Crizotinib耐藥。日本的研究者Choi等[24]在1例Crizotinib治療后復發患者的標本中發現了兩處新突變，即4374G→A和4493C→A。兩個堿基突變分別導致了氨基酸C1156Y和L1196M的改變，從而影響ALK與Crizotinib或ATP的結合。Choi等推測，這兩個點突變能分別獨立導致耐藥發生，其中管家基因L1196M突變導致的耐藥性比C1156Y更強。

針對管家基因L1196M耐藥后的治療，Katayama等[25]提出可以用比Crizotinib活性更強的ALK抑制劑如TAE684及AP26113，或是HSP90抑制劑進行治療。Sakamoto等[26]也用細胞實驗證實了ALK抑制劑CH5424802能高選擇性抑制L1196M突變的細胞生長。

EGFR抑制劑吉非替尼和厄洛替尼目前已經廣泛應用于晚期NSCLC臨床各線的治療。IPASS研究[27]比較了一線使用EGFR-TKIs與一線使用化療藥物的療效，發現EGFR突變患者是吉非替尼治療的最大獲益人群。鑒于IPASS及其他三項基于EGFR突變的臨床試驗研究結果，ASCO于今年4月發布了PCO（provisional clinical opinion），建議對晚期初治的NSCLC患者進行EGFR突變檢測以決定患者是進行EGFR-TKIs治療還是進行化療[21]。

4 EML4-ALK與EGFR突變共存患者的臨床特征

EML4-ALK融合基因型患者與EGFR基因突變型患者有相似的臨床特征[9,28]，如多見于不/輕度吸煙的腺癌患者，但EML4-ALK融合基因型患者多為年輕的男性患者，且不能從EGFR-TKIs治療中獲益[9]。

既往研究[2,6,7,9,13]認為EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變是互為獨立的分子事件，EML4-ALK融合型基因可能是繼KRAS之后的EGFR對TKI耐藥的另外一個原因。目前已報道了8例[4,6,29-31]EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變共存型患者（表1，其中1例無臨床信息未在表中列出），其所表現的臨床特點與既往的研究有所不同。

這7例大部分為女性（4/7）、亞裔（6/7）、無吸煙史（6/7）的晚期患者，中位年齡56歲，病理類型幾乎都是腺癌（6/7），EGFR突變既可以是19外顯子缺失（4/7）也可以是21外顯子點突變（3/7），但EML4-ALK主要是變體1的融合。特別指出的是，在一線使用EGFRTKIs的5例患者中，療效均達到部分緩解（第7例患者二線治療行右上肺切除+淋巴結清掃+肋骨切除術，三線治療使用2個月厄洛替尼后死于疾病進展），這與傳統認為的EML4-ALK融合基因的患者對EGFR-TKIs耐藥的觀點[9]顯然不一致。

5 展望

EML4-ALK融合基因是當前研究的熱點，極有可能像EGFR突變那樣成為NSCLC的一個亞型。PF-02341066（Crizotinib）的III期臨床試驗正在進行，Crizotinib能否像EGFR-TKIs一樣成為NSCLC治療上的一個里程碑值得期待。EGFR-TKIs目前已經廣泛應用于臨床的治療，在治療晚期EGFR突變的NSCLC患者中療效明顯。但對于EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變共存型患者，目前的研究和報道還很少，仍有許多問題值得思考和研究，包括共存型患者其EML4-ALK與EGFR下游的分子生物學行為、案例報道中患者對EGFR TKIs的反應不一致的原因是否為EML4-ALK不同變體對EGFR TKIs的敏感性不同、僅第7例患者對EGFR-TKIs不敏感是否是化療改變了腫瘤對TKIs的敏感性所致、對于共存型患者該如何應用TKIs、多靶點抑制劑會不會是共存型患者的更好選擇、耐藥的機制仍不清楚以及耐藥后患者應如何治療等。期待更加深入的實驗研究和臨床研究來解決上述問題，使患者以最小的花費取得最佳療效，真正在基因水平上實現肺癌的個性化治療。

表 1 7例EML4-ALK 融合基因和EGFR 突變共存患者的臨床特征Tab 1 The clinical features of 8 patients with EML4-ALK fusion gene and EGFR mutation