I、II相藥物代謝酶遺傳多態性與晚期非小細胞肺癌化療療效的關系

李偉英 岳文濤 楊學惠 張春彥 王玥

肺癌是當今世界上發病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一。肺癌中約有80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），由于缺乏有效的早期診斷方法，確診時肺癌多為晚期，因此化學藥物治療在NSCLC的治療中占據主要地位，但對于不同的患者化療效果差異很大。許多資料[1,2]顯示遺傳因素對藥物作用和毒性的影響顯著，諸如編碼藥物代謝酶可以影響抗癌藥物的動力學和藥效參數。藥物代謝酶催化兩個階段反應，大多數藥物都要經過第一階段I相代謝酶反應解毒或者使無活性的前體藥物活化，第二階段II相代謝酶通常結合第一階段產物、其它反應介質或是生成更有利于腎臟或膽汁排泄的極性衍生物，這些酶的多態性可引發治療藥物不同的治療藥物動力學和藥效的分布圖，有研究[3-5]顯示I、II相代謝酶功能型多態性可能影響腫瘤患者的臨床預后。

為了進一步評估I、II相代謝酶功能型多態性與化療療效的關系以及對肺癌患者預后的影響，我們選擇參與藥物代謝第一階段反應的谷胱甘肽硫轉移酶M1（glutathione S-transferase M1, GSTM1）和第二階段反應的細胞色素P4501A1（cytochrome P450 1A1, CYP1A1）、2E1（cytochrome P450 2E1, CYP2E1）、2D6（cytochrome P450 2D6,CYP2D6）作為研究對象，檢測肺癌患者四種基因多態性頻率分布，分析它們與吸煙、化療療效、化療方案、病理分型等因素之間的關系以及與患者生存之間的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取北京胸科醫院2006年1月-2006年6月127例晚期NSCLC患者，所有患者均為細胞學或組織學確診的肺癌，無其它部位腫瘤，既往未經放療和化療。收集研究對象的人口學資料、職業史、吸煙史、飲酒史等，部分資料見表1。

1.2 DNA的提取 收集研究對象的外周血，用常規的酚-氯仿抽提法提取DNA，于-20oC保存。

1.3 基因分型 引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表2，基因分型判斷見圖1-圖4。

1.4 化療方案及療效評價 全部患者的血常規、肝腎功能及體力狀況評分等均具有化療指征，化療2周后進行療效評價。參照RECIST標準判斷療效。對全部患者進行隨訪，最終隨訪日期為2011年1月，總生存期定義為患者診斷之日起至由于任何原因死亡或是末次隨訪時間。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件進行χ2檢驗、方差分析、分層分析及生存分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四種藥物代謝酶與化療療效的關系

2.1.1 單一基因與化療療效的關系（表3） 表3提示缺陷型GSTM1的肺癌患者比功能型GSTM1的肺癌患者化療療效好（P=0.005），攜帶A型CYP1A1的肺癌患者比攜帶的B型和C型CYP1A1肺癌患者化療療效好（P=0.023），而CYP2E1和CYP2D6各基因型之間化療療效沒有統計學差異（P＞0.05）。

2.1.2 兩種或兩種以上基因與化療療效的關系 在兩種或兩種以上基因與化療療效關系的分析中僅GSTM1和CYP1A1有關聯（表4）。表4提示同時攜帶缺陷型GSTM1和B型CYP1A1的肺癌患者比攜帶其它基因組合的肺癌患者化療療效好（P＜0.001）。

2.1.3 四種藥物代謝酶與化療方案的關系 表5和表6分別提示A型CYP1A1患者對非鉑類化療藥物比B型和C型CYP1A1敏感，缺陷型GSTM1患者比功能型患者對鉑類化療藥物敏感。

2.2 四種代謝酶、化療療效、化療方案等因素對肺癌患者生存的影響

2.2.1 單因素對肺癌患者生存的影響 表7及圖5顯示在單因素分析中化療療效、化療方案對肺癌患者生存有影響，化療有效的肺癌患者比化療無效的肺癌患者生存時間長，使用鉑類化療藥物的肺癌患者比未使用鉑類化療藥物肺癌患者生存時間短。而吸煙、病理分型、GSTM1、CYP1A1、CYP2E1和CYP2D6多態性對肺癌患者生存沒有影響（P＞0.05）。

2.2.2 多因素對肺癌患者生存的影響（表8） 由表8可以看出在多因素分析中，CYP2D6、化療方案、化療療效P值在0.05附近波動，為了得到最佳的回歸模型、找到有意義的影響因素，我們按P值大小逐步對CYP2D6、化療方案、化療療效3個變量進行進一步擬合，發現當模型中同時引入化療方案和化療療效2個變量時，模型外其它變量不能再進入，模型內因子不能再剔除，由此我們得到最佳方程模型（表9），篩選出對生存有顯著影響的因素，即化療方案和化療療效，該結果與單因素分析結果一致。

3 討論

目前，國內外對I、II相代謝酶基因多態性與腫瘤化療效果關系的研究已有相關報道，尤以國外為多，但多數研究集中在某一類酶中一種或多種多態性與腫瘤化療關系的研究上，而且研究結果非常不一致[6-8]。GSTM1是II相代謝酶，主要催化GSH與多環芳烴環氧化物共價結合，GSTM1基因多態性分為功能缺陷型和功能型；CYP1A1編碼芳烴羥化酶，在其DNA結構的3'端PolyA下游堿基264T→C突變形成Msp1酶切點。CYP2E1參與亞硝胺及其前致癌物N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基四吡咯烷的代謝，存在Rsa1和Pst1多態位點。CYP2D6ch型多態是由于在第一外顯子上188C→T的突變，使第34位脯氨酸被絲氨酸取代，編碼產生大量無活性酶。本研究我們檢測研究對象GSTM1、CYP1A1、CYP2E1、CYP2D6四個多態位點，分析它們與病理分型、化療藥物、化療效果之間的關系及與患者預后之間的關系。化療有效組和無效組的年齡、性別沒有統計學差異，排除了因年齡、性別分布不均衡可能造成對化療效果的影響。

表 1 研究對象的一般資料Tab 1 General characteristics of the subjects

表 2 CYP1A1、2E1、2D6和GSTM1基因分型引物序列Tab 2 The primer sequences genotyping CYP1A1, 2E1, 2D6 and GSTM1

圖 1 GSTM1基因分型。M：PUC19標志；1、2、5泳道：缺陷型GSTM1（268 bp）；3、4、6泳道：野生型GSTM1（268 bp 和215 bp）。Fig 1 GSTM1 genotyping. M: PUC19 marker； 1, 2, 5 lines: null-GSTM1(268 bp)； 3, 4, 6 lines: wide-type GSTM1 (268 bp, 215 bp).

圖 2 CYP1A1基因分型。M：PUC19標志；2、3泳道：A型CYP1A1（340 bp）；4、5、6、8泳道：B型CYP1A1（340 bp、240 bp和100 bp）；1、7泳道：C型CYP1A1（240 bp和100 bp）。Fig 2 CYP1A1 genotyping. M: PUC19 marker； 2, 3 lines: the A type of CYP1A1 (340 bp)； 4, 5, 6, 8 lines: the B type of CYP1A1 (340 bp, 240 bp,100 bp)； 1, 7 lines: the C type of CYP1A1 (240 bp, 100 bp).

圖 3 CYP2E1基因分型。M：PUC19標志；1、2、3：A型CYP2E1[Rsa1(+/+)/Pst1(-/-)]，P泳道（410 bp）， R泳道（360 bp）；4：B型CYP2E1 [Rsa1(+/-)/Pst1(+/-)]，P泳道（410 bp和290 bp），R泳道（410 bp和360 bp）；5：C型CYP2E1[Rsa1(-/+)/Pst1(+/+)]，P 泳道（290 bp和120 bp），R泳道（410 bp）。Fig 3 CYP2E1 genotyping. M: PUC19 marker； 1, 2, 3: the A type of CYP2E1[Rsa1(+/+)/Pst1(-/-)], P line (410 bp), R line (360 bp)； 4: the B type of CYP2E1[Rsa1(+/-)/Pst1(+/-)], P line (410 bp, 290 bp), R line (410 bp, 360 bp)； 5: the C type of CYP2E1 [Rsa1(-/+)/Pst1(+/+)], P line (290 bp, 120 bp), R line (410 bp).

圖 4 CYP2D6基因分型。M：PUC19標志；1、2泳道：野生型CYP2D6 (213 bp和59 bp)；3、4泳道：突變型CYP2D6（112 bp、101 bp和59 bp）；5、6、7泳道：雜合型CYP2D6（213 bp、112 bp、101 bp和59 bp）。Fig 4 CYP2D6 genotyping. M: PUC19 marker； 1, 2 lines: the w/w type of CYP2D6 (213 bp, 59 bp)； 3, 4 lines: the m/m type CYP2D6 (112 bp, 101 bp and 59 bp)； 5, 6, 7 lines: the w/m type CYP2D6 (213 bp, 112 bp, 101 bp and 59 bp).

表 3 四種藥物代謝酶多態性與化療療效的關系Tab 3 The relationship between the polymorphisms of 4 kind enzymes and chemotherapy effect

表 4 GSTM1和CYP1A1多態性與化療療效的關系Tab 4 The relationship between the polymorphisms of GSTM1, CYP1A1 and chemotherapy effect

表 5 CYP1A1多態性與化療方案的關系Tab 5 The relationship of CYP1A1 polymorphisms and chemotherapy programs

表 6 GSTM1多態性與化療方案的關系Tab 6 The relationship of GSTM1 polymorphisms and chemotherapy programs

表 7 肺癌患者單因素生存分析結果Tab 7 The analysis of survival in the lung cancer patients

圖 5 4種酶、化療效果、化療方案與患者生存之間的關系。A：GSTM1與患者生存之間關系；B：CYP1A1與患者生存之間關系；C：CYP2E1與患者生存之間關系；D：CYP2D6與患者生存之間關系；E：化療方案與患者生存之間關系（CP：化療方案）；F：化療效果與患者生存之間關系（CR：化療效果）。Fig 5 The results of the association between 4 enzymes,chemotherapy response and chemotherapy programs and patients survival. A: the effect of GSTM1 on the patients survival； B: the effect of CYP1A1 on the patients survival； C:the effect of CYP2E1 on the patients survival； D: the effect of CYP2D6 on the patients survival； E: the effect of chemotherapy program on the patients survival (CP: chemotherapy programs)； F: the effect of chemotherapy response on the patients survival (CR:chemotherapy response).

表 8 對肺癌患者生存影響的多因素分析Tab 8 Multivariate analyses of prognosis factors

表 9 化療方案和化療療效對肺癌患者生存的影響Tab 9 the effect of chemotherapy programs and chemotherapy effect on patients survival

我們發現缺陷型GSTM1的肺癌患者比功能型肺癌患者化療療效好，尤其是攜帶缺陷型GSTM1和B型CYP1A1的肺癌患者，而CYP2E1和CYP2D6基因多態性與化療療效之間沒有統計學差異。進一步分析發現攜帶A型CYP1A1肺癌患者接受非鉑類化療藥物治療比A型和C型患者療效好，攜帶缺陷型GSTM1的肺癌患者接受鉑類化療藥物治療比功能型肺癌患者化療療效好。目前它們的多態性是否影響肺癌患者對化療藥物的應答以及對患者預后是否產生影響的研究結果不一致或很少報道，一些結果認為GSTM1缺陷型可能對化學藥物治療產生耐受[9-11]；也有研究[12-15]認為攜帶GSTM1缺陷型等位基因者對化療敏感，這與我們的結果一致，這種研究結果的不一致可能是由于選擇不同的藥物代謝酶多態位點造成的，也可能是同一位點在不同腫瘤對化療藥物應答以及對腫瘤患者臨床預后的影響存在差異。攜帶GSTM1缺陷型的肺癌患者對化療敏感可能與其丟失了解毒的功能，使得化療藥物正常的發揮作用有關。至于攜帶A型CYP1A1肺癌患者接受非鉑類化療藥物治療比A型和C型患者療效好，攜帶缺陷型GSTM1的肺癌患者接受鉑類化療藥物治療比功能型肺癌患者化療療效好的相關報道尚未見報道，這些提示可能對于臨床用藥有一定的幫助。

在單因素生存分析中化療療效和化療方案對晚期NSCLC患者總生存期有影響，即化療療效好的患者比化療療效差的患者生存時間長，使用鉑類化療藥物的肺癌患者比未使用鉑類化療藥物肺癌患者生存時間短，該結論與臨床的結論不太一致。本研究提示缺陷型GSTM1的肺癌患者比功能型的肺癌患者接受鉑類化療方案的化療療效好，但在76例攜帶缺陷型GSTM1中接受鉑類化療方案治療的病例僅有28例（36.84%），其他48例患者接受了化療療效不好的非鉑類藥物治療。而攜帶A型CYP1A1的肺癌患者對非鉑類化療方案比較敏感，在本研究中51例這類患者中接受非鉑類化療方案治療的病例有34例（66.7%）。這種比例的不均衡可能造成了該結論與以往的結論不一致。而吸煙、病理分型、GSTM1、CYP1A1、CYP2E1和CYP2D6多態性對晚期NSCLC患者總生存期沒有影響。

在Cox回歸模型的擬合過程中發現當模型中同時引入化療方案和化療療效2個變量時，模型外其它變量不能再進入，模型內因子不能再被剔除，得到了最佳方程模型，篩選出對生存有顯著影響的因素，即化療方案和化療療效，化療方案和化療療效是影響晚期NSCLC的獨立預后因素。GSTM1、CYP1A1、CYP2E1和CYP2D6多態性對晚期NSCLC患者總生存期沒有影響。有研究[16-,17]認為GSTM1是影響肺癌的獨立預后因素，攜帶缺陷型GSTM1肺癌患者有更短的生存期，也有學者[18,19]認為缺陷型GSTM1有助于改善患者的生存。對于CYP2D6多態性與化療療效以及對腫瘤患者預后影響的研究較多，但由于研究的多態位點不同所以得到的結論也不盡相同[20-25]。關于CYP1A1、CYP2E1多態性與化療療效以及對腫瘤患者預后影響的研究較少。

總之，缺陷型GSTM1的肺癌患者比攜帶功能型GSTM1的肺癌患者化療療效好，尤其是對以鉑類為基礎的化療方案。盡管GSTM1和CYP1A1多態性對晚期NSCLC患者總生存期沒有影響，但是攜帶缺陷型GSTM1肺癌患者對以鉑類為基礎的化療方案相對敏感，因此這部分患者將可能從鉑類為基礎的化療方案中獲益；而A型CYP1A1肺癌患者對以非鉑類為基礎的化療方案相對敏感，因此這部分患者將可能從非鉑類為基礎的化療方案中獲益。