核心蛋白聚糖decorin在非小細胞肺癌組織中低表達且與組織學類型相關(guān)

吳永凱 肖汀 李敏 張瑩 高燕寧 孫克林

肺癌已經(jīng)成為全世界嚴重威脅人類生存健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均列各種腫瘤之首。國家衛(wèi)生部提供的資料顯示，肺癌已成為我國第一大癌癥。核心蛋白聚糖（decorin）是存在于細胞周圍基質(zhì)組織中的一種富含亮氨酸的低分子蛋白多糖，以核心蛋白（44 kDa）和蛋白聚糖（72 kDa-130 kDa, smear）兩種形式表達于組織細胞中[1]。Decorin是細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的組成成分，屬于亮氨酸富集蛋白家族（small leucine-rich proteoglycan, SLRP）成員，參與抑制膠原纖維形成、調(diào)控細胞的增殖和粘附等過程[2]。

本實驗室在前期工作中，利用新型的蛋白質(zhì)組研究體系建立了肺癌相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫以尋找新的肺癌標志物[3]，其中包括decorin。近年來的研究表明decorin可以抑制多種腫瘤細胞系的生長、轉(zhuǎn)移。目前有關(guān)其在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）組織中表達的研究還比較少。本研究通過Western blot和免疫組織化學染色的方法，分析肺癌組織中decorin蛋白的表達情況，探討該蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象及組織樣品 所有臨床組織樣品取自1999年12月-2005年9月中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤外科收治的患者。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）2004年的肺癌組織學分型標準進行肺癌組織學分型，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟 （International Union Against Cancer, UICC）2002年發(fā)布的第6版肺癌TNM分期系統(tǒng)進行分期。所有患者術(shù)前均未接受過物理治療或化學藥物治療。

用于Western blot檢測的新鮮腫瘤組織樣品取自接受手術(shù)治療的16例肺鱗癌（squamous cell carcinoma,SCC）患者。收集手術(shù)切除的腫瘤組織及其配對的遠端正常肺組織。患者男性15例，女性1例，中位年齡65歲（44歲-76歲）。I期2例，II期3例，III期8例，IV期1例，無明確分期2例。高分化2例，中分化5例，低分化7例，無明確分化2例。

采用51例10%甲醛固定、石蠟包埋組織用于免疫組織化學染色。患者男性34例，女性17例，中位年齡53歲（33歲-76歲）。I期14例，II期17例，III期15例，IV期3例，無明確分期2例。高分化3例，中分化23例，低分化25例。

1.2 組織蛋白抽提和保存 取適當大小的組織塊，加入300 μL細胞裂解液（包含RIPA裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑PSMF），置于冰上裂解30 min。裂解液于4oC離心20 min，12,000 rpm。收集上清液，分裝后保存于-80oC冰箱。采用BCA Protein Assay Kit（Pierce, IL, USA）進行蛋白定量。

1.3 Western blot檢測組織樣品中decorin蛋白水平 采用10%SDS-PAGE分離膠電泳分離變性后的40 μg組織蛋白，隨后使用半干式電轉(zhuǎn)儀將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，電轉(zhuǎn)后的膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。膜在decorin鼠單抗溶液（1：1,000, R＆D, USA）中4oC孵育過夜，然后在帶辣根過氧化物酶標簽的羊抗鼠二抗溶液（1：4,000, Jackson ImmunoResearch, USA）中室溫孵育1 h，用發(fā)光試劑盒（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）檢測，X線膠片曝光、顯影、定影。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，使用β-actin鼠單抗（1：3,000, Sigma-Aldrich, USA）作為第一抗體。

1.4 免疫組織化學染色方法 采用SP法，鼠源decorin抗體（R＆D, USA）稀釋度為1：200，染色操作程序參照試劑說明書進行。將石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水；3%H2O2處理15 min，1×PBS洗3次，每次3 min；血清封閉20 min；甩去封閉血清，加稀釋好的一抗，4oC過夜；1×PBS洗3次，生物素標記的二抗，37oC孵育30 min；1×PBS洗3次，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37oC孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染；切片經(jīng)梯度乙醇，二甲苯脫水，中性樹脂膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察。免疫組織化學染色圖片由萊卡DFC425圖像系統(tǒng)采集。

Decorin蛋白顯示細胞漿著色，染色強度判斷標準[4]為：無染色=0，輕度染色（淺黃色）=1，中度染色（棕黃色）=2，強染色（黃褐色）=3；染色面積判斷標準為：無細胞染色=0，＜25%細胞染色=1，25%-50%細胞染色=2，＞50%細胞染色=3。兩種積分相加，按照：（-）=0，（+）=1-2，（++）=3-4，（+++）=5-6。進行半定量判斷，≥（++）為陽性結(jié)果，（-、+）為陰性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。使用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U檢驗比較免疫組織化學染色結(jié)果的組間差異。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測組織樣品中decorin蛋白表達 Decorin以核心蛋白（44 kDa）和蛋白聚糖（72 kDa-130 kDa,smear）兩種形式表達于組織細胞中。16對配對組織蛋白標本中，相對于癌旁肺組織，12例（75.0%）肺癌組織中核心蛋白形式及蛋白聚糖形式的decorin表達水平明顯下調(diào)（圖1）。

2.2 免疫組織化學染色

2.2.1 Decorin蛋白在肺癌組織中的表達明顯下調(diào)（表1，圖2A，圖2B） Decorin在肺癌的腫瘤組織表達陽性率僅為11.8%（6/51），明顯低于正常肺組織（陽性率為53.1%，P＜0.001）。Decorin在正常支氣管中表達的陽性率也很低，為11.8%（4/34）。在高、中、低分化的肺癌組織中decorin的陽性率分別為：12.0%（3/25）、13.0%（3/23）、0（0/3），各組間無統(tǒng)計學差異（P=0.230）。Decorin在肺癌早期（I期+II期）組織中的陽性率為9.7%（3/31），晚期（III期+IV期）為11.1%（2/18），兩組之間無統(tǒng)計學差異（P=0.698）。Decorin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中表達陽性率為12.5%（4/32），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中表達陽性率為5.9%（1/17），兩組之間無統(tǒng)計學差異（P=0.101）。

圖 1 Western blot檢測decorin蛋白在16對配對的肺鱗癌組織（T）及癌旁肺組織（N）中的表達Fig 1 The expression of decorin protein in tumor tissues (T) and corresponding normal tissues (N) from 16 cases of lung squamous cell carcinoma by Western bolt

表 1 非小細胞肺癌組織中decorin蛋白的表達情況Tab 1 Expression of decorin in tissue samples from non-small cell lung cancer patients by immunohistochemical staining

2.2.2 Decorin蛋白在肺癌組織中的表達與組織學類型相關(guān)（表1） Decorin在26例肺腺癌組織中幾乎不表達，陽性率為0（0/26），而在肺鱗癌組織中陽性率為24.0%（6/25），兩組之間存在明顯差異（P=0.006，圖2C）。

圖 2 免疫組織化學法檢測decorin在肺癌組織中的表達。A：Decorin在正常肺泡中表達陽性；B：Decorin在肺腺癌組織中不表達；C: Decorin在肺鱗癌組織中表達陽性。Fig 2 The expression of decorin in non-small cell lung cancer tissues by immunohistochemical staining. A: The positive expression of decorin in normal alveolar； B: The negative expression of decorin in adenocarcinoma； C: The positive expression of decorin in squamous cell carcinoma.

3 討論

Decorin是組織間聯(lián)系的組成成分之一，與I型膠原纖維結(jié)合，在基質(zhì)組裝中發(fā)揮重要作用。Decorin可與細胞外基質(zhì)中的其他分子相互作用，影響細胞間粘附及遷移，可能是腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要抑制因子。外源decorin可通過激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR），調(diào)節(jié)細胞周期蛋白p21通路引起前列腺癌細胞的G1-S阻滯，抑制細胞生長。并且，decorin可以和TGF-β等多種生長因子結(jié)合，負性調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長[5]。

Banerjee等[6]用免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)，在口腔上皮的不典型增生細胞中decorin表達缺失，但在癌組織腫瘤細胞胞核異常表達，并認為這種異位表達使decorin失去了通過與TGF-β結(jié)合而阻斷EGFR通路的能力。Augoff等[2]結(jié)果顯示，相比于正常腸粘膜decorin在腺瘤中的蛋白表達發(fā)生了下降，在常見類型的腸癌組織中表達最弱。這兩位學者的研究提示decorin表達的降低可能是口腔癌和結(jié)直腸癌的早期事件，并且是腫瘤發(fā)生的促進因素。本研究的Western bolt結(jié)果顯示，相對于癌旁正常肺組織，核心蛋白和蛋白聚糖兩種表達形式的decorin在肺鱗癌組織的蛋白含量均明顯降低。我們采用免疫組織化學染色的方法，以進一步明確decorin在肺癌組織中各種細胞（如正常肺泡、正常支氣管、腫瘤等）的表達情況。結(jié)果也表明，肺癌組織中的decorin表達降低，并在不同的病理組織學類型的肺癌中表達陽性率不同。在肺腺癌組織中，decorin幾乎不表達，陽性率為0。與其對照的正常肺泡中，表達陽性率為53.1%，二者存在明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。而在肺鱗癌組織中，decorin蛋白表達的陽性率僅為24.0%。但是，decorin在正常支氣管中表達的陽性率更低，為11.8%。此結(jié)果提示，decorin表達的降低可能不是肺癌發(fā)生的早期階段，而在不同病理類型的NSCLC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用不同，有可能在肺腺癌的發(fā)生中扮演重要角色。

以腺病毒載體轉(zhuǎn)染decorin可抑制乳腺癌細胞系MTLn3的體內(nèi)成瘤和肺部轉(zhuǎn)移[7]。已有研究[8-10]顯示DCN基因在胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中為低表達，Cox分析進一步證明decorin是乳腺癌復(fù)發(fā)及預(yù)后不良的獨立預(yù)后因素。Biaoxue等[11]在肺癌的研究結(jié)果表明，正常肺組織中的decorin表達高于腫瘤組織，并且decorin的低表達與肺癌的不良預(yù)后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。Goldoni等[12]的研究認為，decorin是強有效的抑制乳腺癌原發(fā)灶生長和轉(zhuǎn)移的靶向治療藥物，其機制為抑制ErbB受體酪氨酸激酶的活性。而在本研究中，decorin的低表達與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＜0.05），可能因為實驗所用的病例數(shù)較少。在后續(xù)研究中應(yīng)擴大病例，進一步探討decorin與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。