不同轉(zhuǎn)移潛能人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNAs的篩選研究

魯為山 李書軍 劉彬 李洋 羅猛 孫麗亞 尤嘉琮 周清華

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，約占所有腫瘤的25%，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。臨床資料顯示，多數(shù)患者在就診時(shí)就已經(jīng)有局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在腫瘤完全切除之后仍出現(xiàn)肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌，約占肺癌總數(shù)的80%-85%。因此，研究大細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制和早期分子標(biāo)志，對(duì)于NSCLC的診斷及個(gè)體化治療具有重要意義。

微小RNA（microRNAs, miRNAs）是一類非編碼單鏈小RNA，長(zhǎng)度約為21 nt-23 nt，通過與目標(biāo)mRNAs互補(bǔ)配對(duì)導(dǎo)致mRNAs降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯誘導(dǎo)基因沉默[2]。有研究[3-5]表明，體內(nèi)可能存在與蛋白信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)類似的miRNAs網(wǎng)絡(luò)，而miRNAs網(wǎng)絡(luò)與EMT過程、腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移的表觀遺傳修飾等過程有著密切的聯(lián)系。因此，通過miRNA芯片篩選不同轉(zhuǎn)移潛能人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)，有助于進(jìn)一步研究miRNAs在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，為阻斷NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的信號(hào)通道和逆轉(zhuǎn)NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移表型提供新的靶點(diǎn)和途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 高轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株L9981和低轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株NL9980是周清華教授從人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系WCQH-9801母系細(xì)胞中分離建立起來的，它們具有相同遺傳學(xué)背景、不同的侵襲能力和分子生物學(xué)特性[6,7]（由天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。用含10%小牛血清（FBS,GIBCO）的RPMI1640（Invitrogen, Carlsbad, CA），置于37 °C、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 MiRNA Complete Labeling and Hyb Kit、Gene Expression Wash Buffer Kit和Human miRNA microarray購(gòu)自Agilent公司，mirVana RNA Isolation Kit購(gòu)自Ambion公司，RNase-Free DNase Set(50)購(gòu)自Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自Promega公司，RNA酶抑制劑購(gòu)自Takara公司，熒光定量PCR試劑SYBR?RPremix Ex TaqTM購(gòu)自Takara公司。

1.3 miRNA芯片檢測(cè)L9981和NL9980的miRNA表達(dá)譜

1.3.1 細(xì)胞總RNA提取 當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞，按mirVana RNA Isolation Kit說明書提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA進(jìn)行濃度和純度鑒定，1%凝膠電泳鑒定其完整性。

1.3.2 芯片雜交 用Agilent's miRNA Complete Labeling and Hyb Kit進(jìn)行RNA雜交和洗染。用Rnase-free水將RNA樣品稀釋至50 ng/μL。取2 μL樣品加入去磷酸化混合液總體積至4 μL，混勻后置于37 °C金屬浴中，保溫30 min。在每管樣品中添加2.8 μL 100%DMSO，置于100 °C金屬浴中加熱5 min-10 min。反應(yīng)結(jié)束將樣品迅速轉(zhuǎn)入冰水浴中冷卻。取連接反應(yīng)混合液4.5 μL加入樣品管中混勻，稍離心，置于16 °C溫育2 h。然后將樣品置于真空濃縮儀中完全抽干備用。將抽干的樣品重新溶解在18 μL nuclease-free水中，每管加入4.5 μL配制好的10×GE Blocking Agent，加入22.5 μL的2×Hi-RPM Hybridization Buffer，混勻，置于100 °C金屬浴中加熱5 min。反應(yīng)結(jié)束后，迅速將其轉(zhuǎn)至冰水浴中冷卻5 min。將合適的蓋片放置在Agilent SureHyb chamber底座上。將約45 μL反應(yīng)液吸至蓋片上，將芯片點(diǎn)樣面朝下放在蓋片上，組裝SureHyb chamber，并擰緊。晃動(dòng)組裝好的SureHyb chamber使里面所有氣泡可以自由移動(dòng)。將Sure-Hyb chamber放置在雜交爐上，55 °C、20 rpm雜交20 h。

1.3.3 芯片洗染 從雜交爐中取出Hybridization chamber assembly，小心取下芯片/蓋片，芯片面朝上，浸入Gene Expression Wash Buffer 1中，取下蓋片，迅速將芯片放在slide-staining dish 2的slide rack中。開啟磁力攪拌器，中速攪拌5 min。取出放有芯片的slide rack，吸水紙輕輕吸去上面沾染的液體，放入slide-staining dish 3中。開啟磁力攪拌器，中速攪拌5 min，溫度37 °C。取出slide rack，吸水紙吸去上面沾染的液體。

1.3.4 芯片掃描 芯片結(jié)果采用Agilent掃描儀進(jìn)行掃描。將芯片放在slide holder中，點(diǎn)樣面朝下，放入掃描儀進(jìn)行掃描。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用Feature Extraction進(jìn)行處理分析。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)紊酒篎old Change≥1.5，flags不全為A的基因。Regulation=up為上調(diào)，Regulation=down為下調(diào)。雙色芯片：Log2Ratio≥1或≤-1，flags不為A的基因。

1.4 Real-time PCR驗(yàn)證miR-125a-3p在L9981和NL9980中的相對(duì)表達(dá) L9981和NL9980細(xì)胞總RNA提取同1.3.1。參照Promega反轉(zhuǎn)錄酶說明書取1 μg總RNA為模板進(jìn)行miR-125a-3p mRNA逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR引物：miR-125a-3p：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCTC，U6：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATATGGAAC。以cDNA為模板，參照Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行Real-time PCR，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。Real-time PCR引物序列如下：miR-125a-3p forward primer：GGCTACAGGTGAGGTTCTTG，U6 forward primer：TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC ，common reverse primer：CAGTGCAGGGTCCGAGGT。反應(yīng)條件：95 °C，10 s，1 個(gè)循環(huán)；95 °C，5 s，60 °C，34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5 靶基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)上miRNAs靶基因預(yù)測(cè)軟件（TargetScan, PicTar, miRanda）在線服務(wù)站點(diǎn)，預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因，取3個(gè)軟件預(yù)測(cè)到的基因作為靶基因。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總RNA的定量和完整性分析 應(yīng)用紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度和濃度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，L9981和NL9980總RNA的D260/D280值均在1.9-2.1之間（表1）。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S、18S和5S三條帶均清晰、完整，28S和18S條帶亮度比值約為2：1（圖1），表明提取的總RNA無(wú)降解、無(wú)蛋白污染。

表 1 MiRNA定量檢測(cè)結(jié)果：L9981和NL9980總RNA的D260/D280值均在1.9-2.1之間Tab 1 Information of miRNA samples: L9981 and NL9980 total RNA D260/D280 values were between 1.9-2.1

圖 1 1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果：L9981和NL9980細(xì)胞總RNA的28S、18S和5S三條帶均清晰、完整。Fig 1 Electrophoresis of total RNA samples: L9981 and NL9980 total RNA,28S, 18S and 5S three bands are clear and complete.

2.2 L9981和NL9980細(xì)胞株中差異表達(dá)的miRNAs 將L9981和NL9980細(xì)胞分別進(jìn)行miRNA芯片檢測(cè)，芯片雜交結(jié)果的掃描圖如圖2所示。芯片結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，在具有高低不同轉(zhuǎn)移潛能人大細(xì)胞肺癌L9981和NL9980細(xì)胞株中，共篩選到22個(gè)表達(dá)水平具有明顯差異的miRNAs。與NL9980細(xì)胞相比，在L9981中有13個(gè)miRNAs表達(dá)水平上調(diào)（表2），有9個(gè)miRNAs表達(dá)水平下調(diào)（表3）。

2.3 miR-125a-3p在L9981/NL9980肺癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)水平 我們應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)了miR-125a-3p在L9981和NL9980細(xì)胞株中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-125a-3p在高轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株L9981中的表達(dá)水平明顯低于在低轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株NL9980中的表達(dá)水平（0.476±0.053 vs 1.000±0.096, P=0.004），提示miR-125a-3p可能具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

2.4 miR-125a-3p靶基因的預(yù)測(cè) 我們用3種常用的生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar和miRanda預(yù)測(cè)了miR-125a-3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factors 2, IGF2）在3種軟件中都能夠被預(yù)測(cè)到，而且miR-125a-3p在IGF2的3'非編碼區(qū)（3'untranslated regions, 3'UTRs）區(qū)有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖3），因此IGF2可能為miR-125a-3p的靶基因。

圖 2 芯片雜交掃描圖：在miRNA芯片上進(jìn)行L9981/NL9980 RNA的雜交，每個(gè)樣本重復(fù)3次。Fig 2 Microarray scanning images of hybridization: RNAs of L9981/NL9980 cell lines were hybridized on microarray, each sample repeated three times.

表 2 與NL9980細(xì)胞相比，在L9981細(xì)胞中有13 個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)Tab 2 There are 13 miRNAs up regulated in L9981 cell lines

表 3 與NL9980細(xì)胞相比，在L9981細(xì)胞中有9 個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)Tab 3 There are 9 miRNAs down regulated in L9981 cell lines

圖 3 MiR-125a-3p在IGF2的3’UTR區(qū)有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：一個(gè)位于IGF2的3’UTR的第3,689個(gè)堿基-第3,691個(gè)堿基，另一個(gè)位于IGF2的3’UTR的第3,718個(gè)堿基-第3,724個(gè)堿基。Fig 3 Binding sites of miR-125a-3p in the 3’UTR of IGF2: there are two binding sites in the 3’UTR of IGF2 (one is at position of 3,689-3,691,another is at position of 3,718-3,724). IGF2: insulin-like growth factors 2；UTR: untranslated regions.

3 討論

MiRNAs是一類非編碼的小RNAs，長(zhǎng)度大約為21 nt-23 nt，它們能夠與靶基因mRNAs的3'UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控蛋白的表達(dá)[2]。大約50%的人miRNAs基因位于染色體脆性區(qū)，推測(cè)可能通過擴(kuò)增、缺失或易位在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮效應(yīng)[8]。MiRNAs參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的多個(gè)過程，其中包括細(xì)胞的分裂增殖、細(xì)胞周期、凋亡、血管形成。此外，越來越多的研究表明miRNAs在人類腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起作用。

研究[9]發(fā)現(xiàn)，miR-200c和miR-200b能通過鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒（zinc-finger E-box binding homeobox, ZEB）1和2上調(diào)E-cadherin表達(dá)從而抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。有趣的是，ZEB1和ZEB2也能夠通過與miR-200家族通用啟動(dòng)子的E-box或Z-box結(jié)合抑制miR-200家族的轉(zhuǎn)錄[10]。因此，在miR-200家族和ZEB1/ZEB2之間就形成了負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路來保持EMT和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelial transition,MET）之間的平衡[11]。MiRNA在腫瘤中也能起類似癌基因/抑癌基因的作用。MiR-10b、miR-21、miR-373、miR-378和miR-17-92在乳腺癌中能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[4,12-15]。而有些miRNAs能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，miR-335、miR-206和let-7家族能夠在乳腺癌中起抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[16-18]。雖然，目前對(duì)于肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的研究較多，肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs表達(dá)譜以及miRNA在肺癌轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制尚不清楚。

MiRNA芯片技術(shù)是高通量快速分析miRNAs表達(dá)譜的方法。L9981和NL9980細(xì)胞是周清華教授從人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系WCQH-9801母系細(xì)胞中分離構(gòu)建出來的具有不同侵襲能力和分子生物學(xué)特性的兩個(gè)肺癌細(xì)胞株，是具有相同遺傳學(xué)背景的共源細(xì)胞株，具有高度的可比性。為了研究NSCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs，我們應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選了L9981與NL9980中差異表達(dá)的miRNAs。

我們?cè)贚9981和NL9980細(xì)胞株中共初步篩選到22個(gè)表達(dá)水平具有明顯差異的miRNAs。與NL9980細(xì)胞相比，在L9981中有13個(gè)miRNAs表達(dá)水平上調(diào)，有9個(gè)miRNAs表達(dá)水平下調(diào)。其中miR-125a-3p在NL9980中的表達(dá)是L9981的1.6倍。我們又應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)了miR-125a-3p在L9981和NL9980細(xì)胞中的表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果與芯片結(jié)果趨勢(shì)一致，從而也表明了芯片結(jié)果的可靠性。

MiR-125a是一種miRNA，在http：//microrna.sanger.ac.uk數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)布了miR-125a的兩種成熟體：has-miR-125a-3p和has-miR-125a-5p。已有研究[19]發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p在NSCLC中表達(dá)下調(diào)，并且表達(dá)水平下調(diào)后可抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲，提示miR-125a-3p在NSCLC細(xì)胞中具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。這與我們的研究結(jié)果是相吻合的。此外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示miR-126和miR-183在高轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株L9981中低表達(dá)，而miR-221和miR-222在高轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株L9981中高表達(dá)。

已有研究[20]發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞系中miR-126表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)miR-126的表達(dá)能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGF-A) ，在體內(nèi)和體外上調(diào)miR-126能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖。推測(cè)miR-126可能通過VEGF-A在肺癌中起抑制腫瘤增殖的作用。在肺癌細(xì)胞系中miR-126過表達(dá)可導(dǎo)致信號(hào)接頭蛋白Crk蛋白表達(dá)水平降低，從而抑制肺癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲能力[21]。另外研究[22]顯示，miR-183的表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能負(fù)相關(guān)，而VIL2編碼蛋白Ezrin是miR-183的靶點(diǎn)。提示miR-183可能通過Ezrin抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。而miR-221和miR-222在侵襲性NSCLC和肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平明顯高于低侵襲性或正常的肺和肝細(xì)胞。MiR-221和miR-222以腫瘤抑制因子PTEN和TIMP3為靶點(diǎn)，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）抵抗，并通過激活A(yù)KT通路和金屬蛋白酶促進(jìn)細(xì)胞遷移。此外，癌基因MET可通過調(diào)控c-Jun轉(zhuǎn)錄因子激活miR-221和miR-222的表達(dá)[23]。提示miR-221和miR-222可能具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

MiRNAs通過與它們靶mRNAs的3'UTR區(qū)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合，剪切或沉默靶mRNAs，從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后抑制的作用。要認(rèn)識(shí)miRNAs的作用機(jī)制，需要認(rèn)識(shí)miRNAs和靶基因的相互作用。研究者在研究過程中發(fā)現(xiàn)，miRNAs和靶基因的作用具有規(guī)律性，可以通過軟件來預(yù)測(cè)。TargetScan、PicTar和miRanda是目前常用3種預(yù)測(cè)miRNAs靶基因的生物信息學(xué)軟件[24-26]。我們用這3種軟件預(yù)測(cè)了miR-125a-3p的靶基因。發(fā)現(xiàn)IGF2在這3個(gè)軟件中都能被預(yù)測(cè)到，而且IGF2的3'UTR區(qū)有兩個(gè)miR-125a-3p的結(jié)合位點(diǎn)。因此IGF2最有可能是miR-125a-3p的靶基因。

IGF2位于11號(hào)染色體的短臂[27]，IGF2具有多種功能，參與細(xì)胞的增殖和分化過程。在MyoD基因誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分化早期IGF2表達(dá)水平上調(diào)[29]。當(dāng)父系遺傳導(dǎo)致IGF2缺失時(shí)，鼠胚胎繼承的母系基因失活，而且會(huì)引起出生后侏儒[29]，提示IGF2在細(xì)胞分化、增殖以及胚胎發(fā)育中對(duì)母系基因激活具有重要作用。IGF2的表達(dá)上調(diào)還能夠通過提高ERK1/2的磷酸化促進(jìn)Wilms腫瘤的發(fā)生[30]。在血管生成方面，IGF2能夠在肝細(xì)胞癌中上調(diào)VEGF的表達(dá)[31]，提示IGF2能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生以及腫瘤血管的形成。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IGF2基因在胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起了重要的作用[32]。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IGF2表達(dá)能夠增加乳腺癌惡變的可能性[33]。可見IGF2在多種腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用。

本研究應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選了不同轉(zhuǎn)移潛能人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系miRNAs的差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)22個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。在高轉(zhuǎn)移潛能人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，有13個(gè)上調(diào)和9個(gè)下調(diào)的miRNAs，其中miR-125a-3p的表達(dá)下調(diào)。靶點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示IGF2可能是miR-125a-3p的靶基因。在本研究的基礎(chǔ)上，我們將對(duì)miRNA在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用和分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，為揭示miRNA調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為肺癌早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。