尿毒清顆粒對單側輸尿管梗阻腎間質纖維化大鼠腎臟Toll樣受體4表達的影響

胡志娟，賈曉梅，史亞男，郭 嵐，董春霞，劉 冰，牛 凱

近年來Toll樣受體 (toll like receptor，TLR)在腎臟疾病發病機制中的作用日益受到關注［1］。其中TLR4是由內毒素所編碼的Ⅰ型跨膜受體，主要在內皮細胞、上皮細胞、巨噬細胞及中性粒細胞上表達［2］。在進行性腎臟纖維化過程中，由于基質增加，使巨噬細胞上TLR4的內源性配體暴露增多，如熱休克蛋白60、纖維蛋白原、硫酸類肝素、纖維連接蛋白的EDA、透明質酸等。內源性配體能夠激活TLR4，活化的TLR4及相關配體誘導核因子κB激活，啟動白介素－1、白介素－6、白介素 －8、白介素 －12、腫瘤壞死因子 －α及 CD80與CD86等基因的轉錄，介導各種病原體的識別和免疫活化過程，從而導致腎臟損傷［1］。本研究采用大鼠單側輸尿管梗阻 (unilateral ureteral obstruction，UUO)誘導的腎間質纖維化 (RIF)模型，觀察該模型TLR4的表達，探討TLR4在RIF過程的作用，以及藥物對UUO大鼠腎功能的影響和作用機制，為RIF的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 健康雄性SD大鼠24只 (由河北醫科大學動物室提供)，體質量150～180 g，隨機分成4組，各6只:(1)正常對照組; (2)假手術組; (3)手術組;(4)尿毒清組。手術組和尿毒清組大鼠用硫噴妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，大鼠腹部正中偏左縱切口2 cm打開腹腔，暴露左腎，鈍性分離左輸尿管，于靠近腎盂段處行左輸尿管結扎后縫合腹腔;假手術組打開大鼠腹腔后僅分離左輸尿管，不結扎。模型建立后第2天起，每日8:00尿毒清組用尿毒清顆粒 (廣州康臣生產)50 mg/kg灌胃 (溶于注射用水);其余組給予等量注射用水灌胃。術后14 d處死大鼠。

1.2 觀察指標及檢測方法 大鼠處死時以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，心臟取血標本約3 ml。血肌酐 (SCr)、尿素氮 (BUN)的測定在Beckman全自動生化分析儀上完成。黃嘌呤氧化酶法測定左腎組織的總超氧化物歧化酶 (TSOD)活力、硫代巴比妥酸 (TBA)法測定左腎組織的丙二醛(MDA)水平。試劑盒為上海朗頓生產。

1.3 轉化生長因子－β1(transforming growth factor－β1，TGF－β1)的反轉錄聚合酶鏈反應 (RT－PCR)分析 均采用TRIzol(Invitrogen公司)試劑一步抽提總RNA，再反轉錄成cDNA(反轉錄酶AMV－RT購自美國Promega公司)。以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶 (Promega公司)催化下行PCR，引物由上海生物工程公司合成。actin:正鏈5'1－GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA－3'1，負鏈5'1－GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG－3'1。擴增條件為95℃5 min，然后95℃45 s，55℃45 s，72℃45 s(35個循環)，72℃延伸5 min。擴增目的片段長度為375 bp;TGF－β1:正鏈5'1－CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C－3'1，負鏈5'1－CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C－3'1。擴增條件為94℃2 min，然后94℃30 s，65℃30 s，72℃30 s(27個循環)，72℃延伸5 min。擴增目的片段長度為298 bp;PCR產物經2% 瓊脂糖凝膠電泳 (含0.5 μg/ml溴乙啶)，再用UVP凝膠圖像成像系統進行分析，以待檢測指標與actin吸光度的比值來表示其相對含量 (目的基因相對表達量=目的基因條帶吸光度/actin基因條帶吸光度)。

1.4 腎組織病理及免疫組織化學法檢測TLR4蛋白的表達經4%的多聚甲醛固定的腎組織石蠟包埋，制成3 μm厚的切片，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化行HE染色。采用Evision試劑盒進行免疫組化染色:每張切片滴加山羊血清，室溫下孵育30 min以封閉內源性抗原;傾倒不洗，每張切片加50 μl的第一抗體，4℃孵育過夜;PBS沖洗，每張切片加50 μl第二抗體，室溫孵育30 min;PBS沖洗，DAB顯色;自來水沖洗，蘇木精復染，PBS沖洗返藍，自來水沖洗，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。采用彩色病理圖像分析系統 (北京航空航天大學)，通過光學顯微鏡 (×200)攝取圖像，輸入圖像分析系統內，對圖像進行灰度變換，使陽性面積與背景分開，進行自動測量。對每例切片隨機選取20個不重疊視野，計算陽性面積和整個視野面積的比值 (去除腎血管、腎小球及腎小管管腔所占面積) ，取其平均值進行比較。

1.5 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件進行分析。計量資料用±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。 (

2 結果

2.1 一般情況 肉眼觀察，假手術組腎臟大小形態正常，顏色暗紅;手術組梗阻側腎臟腫大，顏色變淺，有囊性感，內含褐色混濁尿液，腎實質變薄，尿毒清組介于二者之間。

2.2 觀察指標水平的比較 4組大鼠BUN、SCr、T－SOD、MDA水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.01)。其中，假手術組與手術組的BUN、SCr、T－SOD、MDA水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。尿毒清組與手術組大鼠的BUN、SCr、T－SOD、MDA水平比較，差異均有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

2.3 TGF－β1mRNA的表達 4組大鼠TGF－β1mRNA的表達水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.01)。其中，假手術組與手術組、手術組與尿毒清組的TGF－β1mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表2，圖1)。

2.4 腎臟病理改變 光鏡下可見 (HE染色)手術組大鼠腎間質炎性細胞彌漫性浸潤，局灶性加重，腎小管明顯擴張，小管內見大量細胞管型，腎小管上皮細胞腫脹，空泡變性，腎小球、小血管未見明顯病變;尿毒清組腎間質炎性細胞多灶性浸潤，部分腎小管擴張、上皮細胞腫脹，空泡變性 (見圖2)。小管管腔所占面積)，取其平均值進行比較。

表1 4組大鼠觀察指標的水平比較 (±s)Table 1 Comparison of observation indexes among the four groups

表1 4組大鼠觀察指標的水平比較 (±s)Table 1 Comparison of observation indexes among the four groups

注:與假手術組比較，*P＜0.01;與手術組比較，△P＜0.01;BUN=尿素氮，SCr=血肌酐，T－SOD=總超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛

組別 只數 BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)T－SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)正常對照組 6 3.9±1.6 52±11 261±51 1.8±0.4假手術組 6 3.9±1.7 54±11 255±54 1.8±0.3手術組 6 10.9±1.7* 89±13* 125±41* 4.0±0.8*尿毒清組 6 6.5±1.6＊△ 72±15＊△ 187±41＊△ 2.8±0.7＊△F 0.0000 0.0001 0.0001 0.0000 24.76 11.40 11.70 18.13 P值值

表2 4組大鼠TGF－β1mRNA的表達水平 (±s)Table 2 Levels of TGF－β1mRNA among the four groups

表2 4組大鼠TGF－β1mRNA的表達水平 (±s)Table 2 Levels of TGF－β1mRNA among the four groups

注:與假手術組比較，*P＜0.01;與手術組比較，△P＜0.01

mRNA正常對照組 6 0.198±0.035組別 只數 TGF－β1假手術組 6 0.201±0.004手術組 6 0.775±0.014*尿毒清組 6 0.519±0.029＊△F 值0.0000 818.36 P值

2.5 腎組織TLR4蛋白的表達 TLR4在正常大鼠腎臟組織中主要分布在腎近曲小管、遠曲小管、集合管、腎間質區、腎血管等部位，在腎小球系膜區也有一定的表達。4組大鼠腎組織中TLR4表達水平的比較，差異有統計學意義 (P＜0.01)。其中，假手術組與手術組、手術組與尿毒清組的TLR4表達水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表3，圖3)。

表3 4組大鼠腎組織中TLR4表達水平 (± s，%)Table 3 Semi－quantitative analysis of TLR4 proteins by immunohistochemistry in rat kidney of the four groups

表3 4組大鼠腎組織中TLR4表達水平 (± s，%)Table 3 Semi－quantitative analysis of TLR4 proteins by immunohistochemistry in rat kidney of the four groups

注:與假手術組比較，*P＜0.01;與手術組比較，△P＜0.01

組別 只數TLR4正常對照組 6 3.35±0.27假手術組 6 3.57±0.47手術組 6 9.10±0.46*尿毒清組 6 6.40±0.65＊△F 值0.0000 190.31 P值

圖1 TGF－β1mRNA在4組大鼠腎組織的表達Figure 1 TGF－β1mRNA expression of rat kidney of the four groups

圖2 3組大鼠腎組織HE染色 (×100)Figure 2 HE staining of rat kidney in three groups

圖3 3組大鼠腎組織中TLR4表達 (免疫組織化學法，×200)Figure 3 TLR4 expression by immunohistochemistry of rat kidney in three groups

3 討論

RIF是導致各種腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同通路。大量的研究均證實腎小管－間質的損害程度與慢性腎臟疾病 (chronic kidney disease，CKD)患者的腎功能損害程度呈正相關［3］。UUO是目前常用的腎小管間質損傷模型之一，是主要累及腎小管間質的非免疫源性進行性腎損害的實驗動物模型。持續輸尿管梗阻導致腎小管擴張和腎間質缺血，引起腎小管上皮細胞及血管內皮細胞損傷，繼而出現以單核、淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞數量減少和間質纖維組織增生，進而發展為小管萎縮和間質纖維化［4］。

Toll基因最早在果蠅中發現，基因產物表達于細胞膜上，是一類跨膜受體。Toll基因除了參與調控胚胎果蠅背腹軸分化外，還介導果蠅抗真菌感染產生天然免疫反應。1997年，Medzhitov等［5］鑒定和克隆了人的一種果蠅 Toll基因同源體，命名為TLR4。人類TLR4是第一個發現的哺乳動物的Toll樣受體。迄今為止在哺乳動物、人細胞膜上已發現有10種TLRs。TLR4的主要功能是作為脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)的信號轉導受體，LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分。TLR4可在內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞以及心肌細胞中表達。進一步研究發現TLR4不僅是LPS的主要受體，還能識別熱休克蛋白60、纖維蛋白原、硫酸類肝素、纖維連接蛋白的EDA、透明質酸、Taxol等多種病原相關分子模式 (pathogen associated molecular pattern，PAMP)，產生不同的效應［6］。

TLR4介導的信號途徑，包括MyD88的依賴性和非依賴性兩個途徑。MyD88依賴性途徑主要介導NF－κB活化和細胞因子產生，而非依賴性途徑主要負責IFN誘導性蛋白10(IFN－inducible protein 10)、糖皮質激素終止反應基因16(glucocorticoid attenuated response gene16，GARG16)、IFN調節基因 1(IFN－regulated gene1，IRG21) 表達和樹突狀細胞成熟［7］。活化的TLR4利用其胞質作用域與銜接蛋白MyD88的羧基末端相互作用，MyD88用它的死亡域 (death domain)募集下游同樣含死亡域的絲/蘇氨酸蛋白激酸酶 (serine/threonine－kinase)，通過絲/蘇氨酸蛋白激酶的三級酶聯MAPKKK(mitogen－activated protein kinase kinase kinase，或稱 MAP3K)、MAPKK及MAPK啟動細胞內信號傳遞，介導蛋白酪氨酸激酶和P38MAPK的激活而活化轉錄因子 (核因子－κB、AP－1、ATF2等)促進效應細胞表達合成腫瘤壞死因子－α、白介素－1、白介素－6及白介素－8等炎性因子［8］，引起一系列病理生理變化。

文獻表明，在各種病因導致的腎臟損傷過程中，氧化應激起著重要的作用［9］。MDA是在氧自由基作用下發生脂質過氧化反應的一種產物，其本身也能破壞細胞膜的結構與功能，對細胞具有毒性，并能刺激間質細胞膠原基因表達，MDA量的變化提示體內脂質過氧化，間接反映細胞損傷的程度。SOD能清除超氧化物陰離子，可拮抗脂質過氧化，其活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力。氧化修飾的低密度脂蛋白和氧化的磷脂影響TLR4表達和TLR4信號轉導。氧化的低密度脂蛋白上調TLR4表達。氧化的磷脂 (ox－PAPC)通過TLR4介導誘導白介素－28轉錄［10］。氧化應激可能通過TLR4加重腎間質炎癥和免疫反應。本研究結果表明在手術組大鼠，腎功能受損，腎小管間質病變中氧化應激增加，致纖維化因子——TGF－β1的表達明顯增多，表明TGF－β1的高水平表達加速RIF的進程。TLR4在正常大鼠腎臟組織中主要分布在腎近曲小管、遠曲小管、集合管、腎間質區、腎血管等部位，在腎小球系膜區也有一定的表達。手術組大鼠TLR4在上述區域的表達顯著升高，尤其以腎小管及腎間質區增加最為明顯。

尿毒清顆粒由大黃、黃芪、甘草、茯苓、川芎、丹參、白術、制何首烏、姜半夏等組成，具有扶正益氣、祛濁解毒、化瘀生新作用。尿毒清顆粒作為中藥復方制劑，具有多因素、多靶點、綜合表現藥效的特點。其中主要成分大黃具有抑制細胞因子、生長因子生成，抑制腎小球系膜細胞增生及成纖維細胞增殖的作用。

本研究結果表明在尿毒清治療后氧化應激指標下調，RIF減輕。氧化應激反應產物可能作為內源性的TLR4配體，通過激活TLR4，誘導核因子κB激活，啟動白介素－1、白介素－6、白介素 －8、白介素 －12、腫瘤壞死因子 －α和 CD80與CD86等基因的轉錄，介導各種病原體的識別和免疫活化過程從而導致腎臟損傷。因此，在慢性腎衰竭的預防與治療中，抑制自由基的產生，清除已產生的自由基及加強抗自由基等方法可作為抗RIF有效的措施。

1 Hans－Joachim A，Bernhard B，Detlef S.Signaling danger:Toll－Like receptors and their potential roles in kidney disease［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15:854 －867.

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5 Medzhitov R，Preston－ Hurlburt P，Janeway CAJ.A human homologue of the D10－sophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］.Nature，1997，388:394 －397.

6 Maris NA，Dessing MC，Vos AF，et al.Toll like receptor mRNA levels in alveolar macrophages after inhalation of endotoxin［J］.Eur Respir J，2006，28:622 －626.

7 Akira S，Takeda K.Toll－like receptor signalling［J］.Nature Review immunology，2004，4:499－511.

8 Velasco G，Campo M，Manrique OJ，et al.Toll like receptor 4 or 2 agonist s decrease allergic inflammation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2005，32:218 －224.

9 Arago M，Cutrin JC，Mastrocola R，et al.Oxidant stress and kidney dysfunction due to ischemia/reperfusion in rat:attenuation by dehydroepiandrosterone［J］.Kidney Int，2003，64(3):836－843.

10 Walton KA，Hsieh X，Gharavi N，et al.Receptors involved in the oxidized1－Palmitoyl－ arachidonoyl－sn－glycero－3－phosphorylcholine－mediated synthesis of Interleukin－8.A role for Toll－like receptor 4 and a glycosylphosphatidylinositol－anchored protein［J］.J Biol Chem，2003，278:29661－29666.