特發性血小板減少性紫癜患者外周血B1細胞變化與病情及預后的關系

羅洪強，林茂芳，謝萬灼，傅佳萍，封蔚瑩，湯秋霞

特發性血小板減少性紫癜 (ITP)是一種自身免疫性疾病，目前認為其發病與機體的免疫功能紊亂有關，近年來國內外研究提示B淋巴細胞亞群失衡以及細胞凋亡的失常與自身免疫相關性疾病的關系密切［1－2］。本研究觀察了 ITP患者外周血液中B1細胞以及藥物治療后對它們的影響，以便進一步闡明該病的發病機制并對預后做出評估，更有效地運用免疫調節手段進行分層治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2007年1月—2010年10月在我院住院治療的94例ITP患者，診斷符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》第3版［3］，排除其他免疫性疾病。其中男29例，女65例;平均年齡47.5歲 (17～64歲)。94例ITP患者中57例為初治 ITP患者 (初治 ITP組)，其中39例對甲潑尼龍治療有效，18例對甲潑尼龍治療無效;37例為難治性ITP患者 (難治性ITP組)。病程6個月～5年，患者均接受過正規腎上腺糖皮質激素治療6周以上［4］，治療后患者的血小板 (PLT)計數 ＜30×109/L，其中7例曾應用長春新堿或環磷酰胺治療，6例曾用丙種球蛋白治療，5例行脾切除術。治療前皮膚均有不同程度的出血點或瘀斑，月經過多8例，牙齦滲血6例，鼻出血4例，PLT(9～24) ×109/L。選擇同期在我院進行健康體檢正常者20例為對照組，男8例，女12例;平均年齡44.2歲 (21～65歲)。

1.2 觀察指標 外周血CD+19細胞、B1細胞、血小板相關免疫球蛋白 (PAIgG)、PLT計數。

1.3 檢測方法 (1)試劑單克隆抗體CD5－FITC、CD19－PE及陰性對照試劑鼠抗人IgG1－PE均購自法國Immunotech公司。流式細胞儀型號EPICS－XL，為美國Beckman－Coulter公司產品。檢測過程:采用直接免疫熒光法檢測，抽取外周血1.5 ml(抽血后3 h內完成檢測)，將EDTA抗凝全血100 μl和 CD5－FITC、CD19－PE單克隆抗體20 μl置于測定管，而在對照管中加入CD19－PE和鼠抗人IgG1各20 μl作為陰性對照，室溫避光孵育15 min，溶血后上機測定，數據收集后計算出CD+19細胞 (總B淋巴細胞)及B1細胞(CD5+CD+19細胞)百分率。 (2)PAIgG檢測:用流式細胞儀檢測PAIgG，其中血小板相關抗體 (鼠抗人IgG)一抗，羊抗鼠IgG(H+L)二抗FITC2F(ab)2以及陰性對照試劑IgG1(mouse) －PE均購自法國Immunotech公司。(3)幽門螺桿菌 (H.pylori)的檢測通過14C尿素呼吸試驗 (UBT)及H.pylori抗體雙陽性確定。

1.4 治療方法 初治ITP組57例，甲潑尼龍針劑量為1～2 mg/kg靜脈滴注，1次/d，待PLT計數恢復正常后逐漸減量，并改潑尼松片口服維持3～6個月;37例難治ITP組患者抗H.pylori治療前停用所有的免疫抑制劑，治療2周后復查H.pylori和PLT計數。抗H.pylori治療方法:奧美拉唑20 mg 2次/d+克拉霉素500 mg 2次/d+阿莫西林1 000 mg 2次/d，療程2周。

1.5 PLT療效標準 參照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》第三版［3］，(1)顯效:PLT計數恢復正常，無出血癥狀，持續＞3個月。維持＞2年無復發者亦稱基本治愈。 (2)良效:PLT計數升至50×109/L或較原水平上升＞30×109/L，無或基本無出血癥狀，持續＞2個月。 (3)進步:PLT計數有所上升，出血癥狀改善，持續＞2周。(4)無效:PLT計數及出血癥狀無改善或惡化。

1.6 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件進行統計分析，計量資料采用 (ITP組治療前CD+19細胞、B1細胞、PAIgG±s)表示，組間比較采用方差分析或兩獨立樣本的t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗。兩變量間關系采用直線相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組觀察指標比較 3組受檢者治療前外周血CD+19細胞、B1細胞、PAIgG及PLT水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。其中對照組與初治ITP組、難治ITP組治療前CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)，而初治ITP組與難治及PLT水平比較，差異均無統計學意義(P＞0.05，見表1)。

2.2 初治ITP患者甲潑尼龍治療前后觀察指標比較 患者甲潑尼龍治療有效組與無效組患者治療前CD+19細胞、B1細胞、PAIgG水平比較，差異均無統計學意義(P＞0.05);治療后兩組上述指標的水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.01)。治療有效組治療前后CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.01);而無效組患者治療前后的CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 難治性ITP患者抗H.pylori治療前后觀察指標比較 抗H.pylori治療前后患者的CD+19細胞、B1細胞、PAIgG、PLT水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。

2.4 ITP患者外周血B1細胞、PAIgG、PLT計數相關性 57例初治ITP患者外周血B1細胞與PLT計數呈負相關 (r=－0.790，P＜0.05);其中B1細胞＜4%共17例，PLT計數為 (32±5) ×109/L;B1細胞4% ～8% 共26例，PLT計數為(24±5) ×109/L;B1細胞＞8% 共14例 PLT計數為 (10±3) ×109/L。B1細胞與 PAIgG呈正相關 (r=0.821，P＜0.05)。外周血PLT計數與PAIgG呈負相關 (r=－0.754，P＜0.05)。

表1 3組受檢者治療前觀察指標的水平比較 ±s)Table 1 Comparison of the observed indices among the three groups

表1 3組受檢者治療前觀察指標的水平比較 ±s)Table 1 Comparison of the observed indices among the three groups

注;與初治ITP組比較，*P＞0.05;與其他兩組比較，△P＜0.05。PAIgG=血小板相關免疫球蛋白，PLT=血小板

組別 例數 CD+19細胞(%) B1細胞(%) PAIgG(%) PLT(×109/L)對照組 20 11.1± 7.4△ 2.1±1.2△ 12± 8△ 158±46△初治ITP組 57 21.0±10.0 9.2±5.2 28±19 26± 8難治ITP組 37 21.4± 7.2* 9.2±4.9* 33±14* 18± 9*F＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 4.56 5.37 3.98 6.24 P值值

表2 初治ITP患者甲潑尼龍治療效果與觀察指標水平的關系 (±s)Table 2 Correlations between curative effects of methylprednisolone and the observed indices in untreated patients

表2 初治ITP患者甲潑尼龍治療效果與觀察指標水平的關系 (±s)Table 2 Correlations between curative effects of methylprednisolone and the observed indices in untreated patients

注:與治療前比較，*P＜0.05;與治療前比較，△P＞0.05

組別 例數 CD+19細胞 (%)治療前治療后有效組 39 20.8± 9.1 11.1± 4.6* 8.9±15.2 2.5±1.8* 27± 4 13±8* 26±4 216±65治療后B1細胞 (%)治療前 治療后PAIgG(%)治療前 治療后PLT(×109/L)治療前*無效組 18 20.3±10.0 18.7±10.4△ 8.8± 5.3 7.9±5.6△ 31±26 25±3△ 20±5 23± 5△t 0.18 2.97 0.07 4.00 0.65 8.2 4.48 18.43 P值 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01值

表3 難治性ITP患者抗H.pylori治療前后觀察指標比較 (±s，n=37)Table 3 Comparison of the observed indices before and after eradication of H.pylori in refractory patients

表3 難治性ITP患者抗H.pylori治療前后觀察指標比較 (±s，n=37)Table 3 Comparison of the observed indices before and after eradication of H.pylori in refractory patients

抗HP治療 CD+19細胞(%) B1細胞(%) PAIgG(%) PLT(×109/L)21.4±7.2 9.2±4.9 33±14 18± 9治療后 15.3±4.4 4.9±3.6 19± 3 48±12 t治療前2.75 2.15 2.54 3.12 P值值＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01

3 討論

ITP是一種血小板免疫性破壞、外周血中PLT計數減少的出血性疾病，其發病機制尚不清楚，近幾年來許多國外學者Arita等［5］研究表明 ITP患者 B1細胞(CD5+B淋巴細胞)水平表達異常，在ITP發病中所起的作用越來越受到重視，其主要表現為B1細胞水平及PAIgG明顯升高，B1細胞水平及PLT計數水平呈明顯負相關，病情緩解后B1細胞水平下降［6－7］。

本研究結果顯示57例初治ITP患者外周血B1細胞與PLT計數呈中度負相關，B1細胞與PAIgG呈中度正相關，外周血PLT計數與PAIgG呈中度負相關。在甲潑尼龍治療有效組，治療后患者外周血B1細胞及PAIgG水平明顯下降，而無效組B1細胞及PAIgG水平未見下降，說明甲潑尼龍治療后，療效較好的患者其外周血B1細胞水平逐漸下降并恢復正常，使免疫狀態達到新的平衡;而治療無效的患者其B1細胞水平未見下降，說明治療后仍處在免疫功能紊亂狀態，提示患者B1細胞水平與病情及預后存在一定的相關性，可作為評估預后及療效的一項參考指標，也可能是判定ITP治療后免疫功能是否恢復正常的一種參考指標;若結合PAIgG水平及其他的臨床相關資料，有可能為不同患者進行分層治療提供依據。當然B1細胞水平與ITP的發生和療效的關系，還有待進一步隨機雙盲的大樣本研究驗證。

目前國內外研究還顯示ITP發病與各種病原體感染如病毒、細菌有關［8－9］，感染后引起人體內免疫功能紊亂，從而導致PLT計數下降。其中H.pylori感染目前被認為是引起ITP的確切的病因之一［4］，其可能機制是H.pylori與血小板某些抗原成分存在交叉性，感染后易被機體免疫系統識別，產生 PAIgG［10］，或慢性炎癥使機體細胞因子網絡發生變化，產生免疫失耐并激活B淋巴細胞，但H.pylori感染后是否通過激活B1淋巴細胞引起免疫功能紊亂，目前尚不明確。

本研究通過對37例H.pylori感染的難治性血小板減少性紫癜 (RITP)患者治療前后外周血B1淋巴細胞、PLT計數進行監測分析發現，RITP患者外周血B1細胞的數量明顯高于正常者，分別為(9.2±4.9)% 和 (2.1±1.2)%，這與國外的研究結果一致［11－12］，提示B1細胞在ITP發病過程中有重要的作用。有效抗H.pylori治療后37例RITP外周血B1細胞水平總體上較治療前有所下降， (4.9±3.6)% 和 (9.2±4.9)%，PLT計數較治療前有所上升，(48±12) ×109/L和(18±9) ×109/L，有效抗 H.pylori治療后，PLT計數有所上升，而B1細胞水平有所下降，說明抗H.pylori有效治療與B1細胞的變化存在一定的相關性，換角度說，以上結論間接提示H.pylori感染引起ITP的發病可能通過B1細胞途徑而發揮作用，當然這還有待于進一步的臨床與基礎研究來證實。

本研究對初治ITP患者用激素治療以及難治性ITP患者抗H.pylori感染治療前后B1細胞水平變化進行分析，使我們更清楚地看到B1細胞在ITP發病中的重要作用，提示ITP患者外周血B1細胞水平與病情及預后存在一定的相關性。

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