桑生除痹合劑對兔膝骨性關節炎組織形態學和血液流變學的影響

王 平，盧啟貴，徐 展，孫克民，黃東紅，裴代平

（深圳平樂骨傷科醫院關節病科，廣東 深圳 518010）

骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人常見、多發和比較難治的一種慢性進行性骨關節病。隨著年齡的增長和社會人口老齡化進程加劇，OA的發病率明顯增高，嚴重危害著中老年人的健康。桑生除痹合劑是國家級名老中醫郭春園教授的經驗方，經深圳平樂骨傷科醫院制劑車間按現代工藝生產用于治療骨性關節炎，經多年臨床應用收到較好的效果。本實驗旨在通過組織病理切片技術、血液流變學分析，觀察桑生除痹合劑對家兔膝關節炎的軟骨、滑膜組織的病理改變和血液流變學的影響，研究桑生除痹合劑防治0A的作用機制。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康6月齡新西蘭大白兔36只，體質量（2 000±100）g，雌雄各半，由上海醫用動物實驗中心提供，合格證書：SCXK(滬)2002-0011。采用一兔一籠喂養方式，室溫20～25℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥物 桑生除痹合劑由深圳平樂骨傷科醫院制劑室提供，制劑批準文號：粵藥制字04000136。藥物：桑寄生、續斷、山藥、枸杞子、五加皮、骨碎補、防風、羌活、防己、秦艽、威靈仙、白術、茯苓、澤瀉、當歸、川芎、白芍、生地黃、川牛膝、牡丹皮、地龍、木瓜、甘草。壯骨關節丸主要由狗脊、骨碎補、淫羊藿、獨活、木香、雞血藤、川斷、熟地黃等藥物組成（南方制藥廠生產，批號：N20050815）。

1.1.3 試劑 蘇木素染色液；伊紅染色液；麗春紅酸性品紅液；苯胺藍液；Weigert氏鐵蘇木精；MAIXINBIO RapId CalImmunoTM快速脫鈣液（福州邁新生物技術開發有限公司提供）。

1.1.4 儀器 北京世帝R80-A全血黏度儀；德國MicroTec CUT 4060切片機；顯微鏡日產Olympus vanox型。

1.2 方法

1.2.1 動物分組方法 隨機分為6組，正常組：正常喂養；模型組：造模后不用藥；余下4組，壯骨關節丸組：造模后灌服壯骨關節丸；桑生除痹合劑低、中、高劑量組（以下簡稱低、中、高劑量組）：造模后灌服低、中、高劑量桑生除痹合劑。

1.2.2 模型制作 同等條件下適應性喂養1周后，取模型組、壯骨關節丸組、桑生除痹合劑低、中、高組，均按照Hulth法行改良手術造模[1]，各組動物于手術前禁食水10 h，以兔左膝為手術對象，無菌條件下實行手術。術前用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg的劑量行耳緣靜脈麻醉，并配合鹽酸利多卡因注射液局部肌注麻醉以松弛肌肉。麻醉后，將兔仰臥捆綁于兔解剖臺上，左膝關節局部脫毛、備皮、消毒、鋪巾，取髕內側縱切口，長約2 cm，依次切開皮膚，淺、深筋膜，在直視下分離、切斷內側副韌帶，打開膝關節腔，完整摘除內側半月板并切斷前交叉韌帶，術中盡量避免損傷關節軟骨面，抽屜試驗、內側應力實驗證實各韌帶完全切斷后，沖洗，徹底止血，逐層縫合，無菌敷料包扎，不固定傷肢。

1.2.3 給藥方法 術后連續3 d青霉素肌注20萬單位，每日2次，以預防感染。手術1周后，每天強迫動物活動30 min，分2次驅趕。給藥劑量均按50 kg成年人體表面積換算，每天灌胃量為10 mL。高劑量組含生藥量為5.06 g/mL；中劑量組含生藥量為2.53 g/mL；低劑量組含生藥量為1.27 g/mL。壯骨關節丸組每天灌胃量為10 mL，含生藥量為0.12 g/mL。將藥物碾磨，用生理鹽水配制成濃度為0.12 g/mL混懸溶液。藥物置4℃冰箱中保存備用。

1.2.4 標本采集 用靜脈空氣栓塞法處死實驗動物，立即打開兔患膝關節腔，用手術解剖刀緊貼關節囊內壁，小心剝取膝關節前正中的部分關節滑膜，置入EP管內，10%福爾馬林固定。用骨剪取股骨內側髁關節負重區軟骨，修成5 mm×5 mm×3 mm的全軟骨層標本，10%福爾馬林固定，MAIXIN-BIO Rapid Cal Immuno TM快速脫鈣液脫鈣，梯度乙醇常規脫水，二甲苯透明后浸蠟包埋。連續4μm厚切片，鋪片，烘干，滑膜標本作HE染色，軟骨標本1份作HE染色，1份作Masson三色染色。各組動物于取材前禁食10 h，將兔仰臥位固定于兔臺上，備皮，用注射器滴入少許2%肝素生理鹽水，使之充滿骨穿針腔。用一次性注射器自耳中動脈抽取4 mL血，注入抗凝試管，搖勻，室溫下保存，3 h內送檢。

1.2.5 觀察指標 （1）關節滑膜及軟骨病理組織學觀察：光鏡下觀察關節滑膜及軟骨組織形態學改變。（2）血液流變學測定：全自動血液流變儀檢測血流變學指標。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 桑生除痹合劑對兔膝關節軟骨、滑膜的組織形態學的影響

圖1（1-3）（1）均為正常組關節軟骨面表面平滑，無鈣化，表層細胞小而扁平，少見細胞分裂，4層結構清晰可辨，軟骨細胞排列成柱狀，未見軟骨細胞簇，潮線完整；（2）Masson染色軟骨膠原藍綠色，鈣化軟骨及骨的膠原呈紅色；（3）滑膜細胞呈單層排列，間質無水腫，無炎性細胞浸潤聚積，有的可見少量毛細血管增生；圖1（4-6）（4）均為模型組關節軟骨表層菲薄，粗糙，部分因受蝕損，表面剝脫、纖維化，形成缺損區，可見多個空隙窩，部分區域成絨毛狀，表層裂隙多且深，向下能深達輻射層，裂隙中可見稀疏結締組織及松散的網狀連接，裂隙周圍可見脫水固縮壞死的軟骨細胞，軟骨細胞排列不規則，各層結構不易分辨，潮線多不完整或完全消失，軟骨細胞增生顯著，大部分是散在增生和巢狀增生，部分軟骨細胞核固縮壞死，偏于一側，鈣化層可出現軟骨細胞簇積現象；（5）Masson染色見軟骨藍綠色染色丟失嚴重，潮線上普遍有向上的火焰狀突起的紅染物，幾乎達到軟骨表層；（6）滑膜明顯增厚，纖維組織大量增生，滑膜可見大量炎性細胞浸潤、聚積，滑膜下毛細血管增生，間質水腫；圖 1（7-9）（7）均為壯骨關節丸組軟骨面粗糙，表面有少許表淺裂隙，但裂隙表淺，軟骨細胞排列較整齊，呈柱狀，表淺層軟骨細胞大量消失，放射層軟骨細胞萎縮，鈣化層軟骨細胞輕度成簇，但細胞增生明顯少于模型組，潮線較整齊，部分軟骨剝脫，出現少許空隙窩；（8）Masson染色見全層未鈣化軟骨藍綠染色達2/3以上，紅色火焰狀升起相對低而少；（9）滑膜細胞、纖維組織輕度增生，毛細血管增生，間質有水腫，伴有少量淋巴細胞浸潤；圖 1（10-12）（10）均為中劑量組軟骨表面尚光滑，軟骨細胞排列整齊，呈柱狀，未見明顯軟骨剝脫，無明顯空隙窩，細胞減少現象不明顯，軟骨細胞核萎縮，細胞增生散在，簇狀增生少見，潮線完整，未見有軟骨蝕損；（11）Masson染色全層沒鈣化軟骨藍綠染色保存較完整；（12）滑膜未見明顯炎性細胞浸潤，滑膜上皮無增生及間質水腫；圖1（13-15）均為低劑量組關節軟骨變化基本同模型組；圖1（16-18）均為高劑量組介于模型組、壯骨關節丸組之間，較壯骨關節丸組退變重。結果見圖1。

圖1 桑生除痹合劑對兔膝關節軟骨、滑膜的組織形態學影響光鏡圖（×200）

2.2 桑生除痹合劑對兔血液流變學的影響

全血黏度低切變模型組和正常組、壯骨關節丸組、中劑量組、高劑量組間差異有統計學意義 (P＜0.01)，與低劑量組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，正常組、壯骨關節丸組和各治療組間差異無統計學意義(P＞0.05)；中切變模型組和正常組、中劑量、高劑量組間差異有統計學意義(P＜0.01)；模型組和壯骨關節丸組間差異有統計學意義(P＜0.05)，正常組、壯骨關節丸組和各治療組間差異無統計學意義(P＞0.05)；高切變模型組和正常組、中劑量組、高劑量組間差異有統計學意義(P＜0.01)，和壯骨關節丸組、低劑量組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，低劑量組和中劑量組間差異有統計學意義(P＜0.05)。全血還原黏度低切變模型組和壯骨關節丸組、中劑量組、高劑量組間差異有統計學意義(P＜0.05)；中切變模型組和正常組間差異有統計學意義(P＜0.05)，模型組和壯骨關節丸組及各治療組間差異有統計學意義(P＜0.01)，正常組、壯骨關節丸組和各治療組間差異無統計學意義(P＞0.05)；高切變模型組和壯骨關節丸組、低劑量組、中劑量組間差異有統計學意義(P＜0.05)。血漿黏度壯骨關節丸組和低劑量組間差異有統計學意義(P＜0.05)，低劑量組和中、高劑量組間差異有統計學意義(P＜0.05)。紅細胞聚集指數模型組和正常組、壯骨關節丸組、高劑量組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 桑生除痹合劑對兔膝OA模型血液流變學的影響 s，n=6）

表1 桑生除痹合劑對兔膝OA模型血液流變學的影響 s，n=6）

注：與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與中劑量組比較 &P＜0.05；與高劑量組比較 #P＜0.05；與低劑量組比較$P＜0.05。

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3 討論

骨性關節炎 (OA)實驗動物模型的建立是研究OA病理機制及防治的必要手段，經大量的實驗研究證實，誘發模型中，Hulth造模方法成功率較高，造模手術后5 d即有軟骨退變出現，術后6周即可獲穩定OA。本實驗采用改良Hulth造模方法，唯一區別于Hulth的方面，只是切斷前交叉韌帶，而不是將前后交叉韌帶都切斷。這樣做使實驗動物膝關節尚存一定的穩定性，不致于加重對膝關節的破壞。本實驗造模方法較Hulth造模法操作簡單、創傷小，通過手術造成的膝關節長期慢性應力失常，最終發展為膝0A。此模型導致軟骨退變基本符合臨床上的發生機理。同時為了縮短動物模型制作期，根據臨床上超疲勞活動容易提前出現OA的發病特點，對模兔采用單籠喂養，使之有一定活動范圍，并每日驅趕動物以增加術側膝關節的磨損及負重機會。通過觀察實驗兔的一般情況，發現模型組家兔均有不同程度的左膝關節跋行、關節活動范圍受限及關節畸形等表現，與OA病人的臨床癥狀與體征相似；同時本實驗模型組組織形態學及檢測指標來看，也證實術后其軟骨退變己非常明顯，與臨床骨關節炎的病理改變相似，從而證實了改良Nulth造模在本次實驗應用的可靠性及可行性。

OA在中國傳統醫學中歸屬痹病之骨痹范疇。近年來，中藥在防治OA的實驗研究方面取得了很大進展，葉俊星等[2]用骨痛膠囊治療兔OA,證明骨痛膠囊內服能有效的降低兔膝關節骨內高壓，明顯改善骨髓內血液流變學狀態。童敏等[3]運用骨康合劑對兔膝OA治療，結果顯示骨康合劑能通過改善骨關節炎血流動力學和血液流變學狀態，防止退行性改變。陳飛雁等[4]在觀察威靈仙注射液對骨關節炎模型動物關節軟骨膠原表型的作用中發現，威靈仙組能夠延緩異常膠原表達的出現，有效緩解基質膠原降解破壞的程度。胡敏等[5]研究益氣通絡方對兔軟骨細胞活性及代謝反應的調節規律，發現益氣通絡方通過阻斷分解代謝細胞因子,防止膠原纖維轉型而促進細胞增殖。師彬等[6]證實活骨丸能夠改善股骨頭血液流變學特性，改善微循環，扭轉股骨頭缺血狀態，促進骨髓修復再生，抑制股骨頭壞死的發生與發展。桑生除痹合劑采用深圳市平樂骨傷科醫院國家級名老中醫郭春園教授的經驗方，經本院制劑車間按現代工藝生產，用于治療骨性關節炎方，經多年使用收到較好的效果。功能補腎健骨、化痹止痛，主要用于治療骨性關節炎的筋骨痿軟、腫脹疼痛等癥。從關節軟骨的退變來看，模型組關節軟骨破壞嚴重，壯骨關節丸組和治療組均顯示存在軟骨增生、龜裂、局部缺損，但經藥物治療，壯骨關節丸組、實驗Ⅱ組、實驗III組退變程度明顯小于模型組，表明桑生除痹合劑可以減少或阻斷軟骨的丟失，修復損害的軟骨。現代研究認為滑膜炎癥在OA的發病中起著重要的作用，吳紅娟等[7,8]的實驗提示，藥物對OA的療效與其能降低關節滑液NO水平有關。實驗中組織學觀察見模型組滑膜充血水腫甚至增生。關節囊肥厚、增生、粘連，滑膜炎性表現嚴重。而治療組的炎性細胞浸潤明顯低于模型組，證實桑生除痹合劑可以作用于軟骨及滑膜細胞，抑制炎性介質的釋放，減輕滑膜炎癥，增加軟骨細胞的代償能力，達到防治OA的效果。近年來，許多學者證實，中藥可促進軟骨細胞增殖和抑制軟骨細胞凋亡[9-11]。在實驗中觀察到中劑量組、高劑量組的家兔關節軟骨面雖也有粗糙，但裂隙表淺，細胞增生散在，簇狀增生少見，且未見軟骨蝕損，明顯優于模型組。我們認為桑生除痹合劑可以增加軟骨細胞的代償能力，調整軟骨細胞的代謝向正常軌道轉換，進而促進軟骨機制中的代謝成分向正常方向改變，并且還可提高細胞的耐受力，對軟骨的降解起一定的緩解作用，具有良好延緩軟骨退變的作用。從基質著色改變方面觀察：模型組動物開始即有基質著色的淺弱和不均，表現更為嚴重，有些部位則全部丟失，壯骨關節丸組、中劑量組、高劑量組也有著色的減少，但減少程度輕，中劑量組趨于正常。實驗組在丟失嚴重的部位見到軟骨細胞周圍的濃染，說明軟骨細胞仍在旺盛地合成基質，揭示用藥組的軟骨細胞受到藥物影響，具有更強、更持久的合成基質的能力。本實驗表明桑生除痹合劑可以減少或阻斷軟骨片的丟失和刺激滑液分泌的途徑，修復損害的軟骨，延緩軟骨退變，對膝OA滑膜增生和炎細胞浸潤有抑制作用，對OA病變發展有抑制作用，其中中劑量組療效更佳。

研究表明靜脈瘀滯、骨內高壓可能是骨性關節炎發病的原發因素，骨內微循環障礙是其關鍵環節。骨內靜脈瘀滯首先是微循環瘀滯，從而引起骨內高壓的主要因素已獲普遍認可。在形成骨內高壓這一過程中，血液流變學異常表現為：血細胞壓積增加，全血和血漿比粘度增加，血漿纖維蛋白原增加，凝血速度加快，紅細胞和血小板在血漿中電泳緩慢，紅細胞沉降率加快。由于這些變化，使血液運行不暢，易致血栓形成、血管栓塞，靜脈回流受阻。靜脈瘀滯引起骨內壓力升高，進而導致骨內血液灌注量減少，使骨內呈貧血狀態，造成骨髓組織缺血、缺氧，酸性代謝產物聚積，滑膜也因關節內高壓而使血流量減少，靜脈郁積導致滑膜分泌酸性滑液，微循環系統的局部反饋機制失調，毛細血管周圍肥大細胞釋放組織胺，血漿外滲，引起組織水腫及微循環血液的濃縮，血栓形成，從而導致血液灌注量進一步減小，骨內壓和關節內壓進一步升高，如此形成惡性循環[2]，不可避免的破壞局部組織的正常理化環境，從而導致關節軟骨的退行性改變。從實驗結果看，全血黏度、全血還原粘度模型組和壯骨關節丸組、中劑量組、高劑量組間差異有統計學意義，紅細胞聚集指數模型組和壯骨關節丸組、高劑量組間比較差異有統計學意義，說明造模3月后血液粘滯性增加，經藥物干預后可明顯改善血液粘滯性，其中以高劑量組最佳，療效與劑量呈相關性。本實驗結果證實了桑生除痹合劑能顯著改善血液流變學狀態，從而達到保護關節軟骨、治療骨性關節炎的目的。

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