靳 磊，賀月林，劉 紅，王 震

（湖南省微生物研究所，湖南 長沙 410009）

化學(xué)農(nóng)藥的大量使用給環(huán)境帶來了嚴(yán)重污染，隨著人類可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的提出，蟲生真菌在害蟲的持續(xù)控制及維護(hù)生物多樣性方面所發(fā)揮的作用越來越受到人們的關(guān)注。目前，在農(nóng)林害蟲生物防治方面，真菌是研究、生產(chǎn)和應(yīng)用最多的生物類群之一。其中，球孢白僵菌（Beauveria bassiana Vuillemin）是一類廣譜性昆蟲病原真菌，研究表明，此菌能侵染15個(gè)目149科的700多種昆蟲[1-3]。在我國，球孢白僵菌廣泛應(yīng)用于桃小食心蟲、馬尾松毛蟲和玉米螟等害蟲的防治[4-8]。

然而，在我國白僵菌的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，存在產(chǎn)孢量少、產(chǎn)孢周期長等不利因素。因此，通過菌種誘變選育來提高生產(chǎn)菌株的產(chǎn)孢量，對(duì)提高白僵菌工業(yè)化生產(chǎn)效率有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)選用一種效果好、設(shè)備簡單、對(duì)人體無傷害的紫外誘變方法，對(duì)球孢白僵菌進(jìn)行紫外誘變以獲得高產(chǎn)菌株，再進(jìn)行繼代培養(yǎng)，最終得到產(chǎn)孢量大，生長速度快、致病能力強(qiáng)、遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良菌株，以供工業(yè)化生產(chǎn)所需。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 球孢白僵菌403001：由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心購買，湖南省微生物所菌種保藏室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（PDA）。稱取去皮馬鈴薯200 g。切成小塊，加1000 mL水，煮沸1 h，用雙層紗布濾成清液，加瓊脂2%，用0.4 mol/L乳酸調(diào)pH為5.7。平板分離培養(yǎng)基：同上。

1.1.3 試驗(yàn)用蟲 2～3齡越冬代馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus），取自湖南省森林植物公園。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)孢量測(cè)定 以50 μL微量注射器將菌株以107個(gè)/mL的孢子懸浮液接種到鋪有玻璃紙的平皿上，培養(yǎng)7 d。洗下玻璃紙上的全部孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取3次計(jì)數(shù)平均值。

1.2.2 誘變劑量的確定 取濃度為107個(gè)/mL球孢白僵菌孢子懸浮液5 mL，加入φ 90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，先預(yù)熱紫外燈30 min，然后開啟平皿蓋于磁力攪拌下分別處理 5、10、15、20、25、30 min（15 W，30 cm），然后稀釋至10-6倍，分別吸取后3個(gè)稀釋度的孢子懸浮液各0.2 mL涂布平板培養(yǎng)6～7 d，計(jì)算致死率（紫外誘變致死的孢子數(shù)與未經(jīng)誘變總孢子數(shù)的比值）和正突變率（產(chǎn)孢量超過出發(fā)菌株403001兩倍為正突變的菌落，正突變的菌株與總菌株個(gè)數(shù)的比值稱正突變率），以致死率70%～80%、正突變率最高為最適劑量。

1.2.3 致病力測(cè)定 用原菌株和篩選出的突變菌株，制成107個(gè)/mL濃度的孢子液，用喉頭噴霧器對(duì)2～3齡越冬代馬尾松毛蟲定量噴霧。每株菌5個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10條蟲，對(duì)照組噴無菌水。馬尾松毛蟲接種后放在玻璃瓶內(nèi)，用松針飼養(yǎng)，紗布封口，灑水保濕，25℃下每天更換新鮮松針，同時(shí)檢出死蟲，將其保濕培養(yǎng)，觀察是否白僵菌感染致死，統(tǒng)計(jì)死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變劑量的確定

球孢白僵菌403001的孢子懸浮液經(jīng)紫外照射不同時(shí)間后，取樣稀釋，涂布于固體培養(yǎng)基上，每樣做3皿，10 d后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，取平均值計(jì)算誘變致死率，并用孢子計(jì)數(shù)法檢測(cè)產(chǎn)孢能力，計(jì)算正突變率，誘變時(shí)間與致死率和正突變率之間的關(guān)系見圖1。

圖1 誘變時(shí)間對(duì)致死率和正突變率的影響

由圖1可知，隨著紫外線照射時(shí)間的延長，孢子的死亡率逐漸提高，在20 min之前正突變率隨著時(shí)間的延長而提高，但繼續(xù)照射，正突變率降低；在20 min時(shí)，正突變率最高，達(dá)32.2%。因此，選擇20 min為最佳的誘變時(shí)間。

2.2 突變株初篩

出發(fā)菌株403001經(jīng)紫外誘變20 min后，稀釋并涂布到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到46個(gè)單菌落（表1），其中有15株正突變，31株負(fù)突變，正突變率為32.6%。

2.3 優(yōu)良突變株篩選

對(duì)紫外誘變后產(chǎn)孢量高于出發(fā)菌株2倍以上的突變株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼續(xù)觀察產(chǎn)孢量和產(chǎn)孢特性的穩(wěn)定程度（表2）。經(jīng)半年4次繼代培養(yǎng)，403001的突變株中，仍有6株的產(chǎn)孢量高于出發(fā)株產(chǎn)孢量2倍以上，只有3株的產(chǎn)孢量低于出發(fā)株。

對(duì)保持較高產(chǎn)孢量的突變株403001-1、403001-22、403001-35和403001-38繼代培養(yǎng)至第10代，以第一代403001菌株為空白對(duì)照，將以上4株突變株對(duì)2～3齡越冬代馬尾松毛蟲進(jìn)行毒力測(cè)定。結(jié)果（表3）表明，突變株403001-38培養(yǎng)性狀最為穩(wěn)定，繼代培養(yǎng)10代后，對(duì)2～3齡越冬代馬尾松毛蟲的致死率為72%，為出發(fā)菌株403001的2.1倍。

表1 紫外誘變后得到的單菌落產(chǎn)孢量變化情況

表2 繼代培養(yǎng)后突變菌株產(chǎn)孢量測(cè)定

表3 正突變株繼代培養(yǎng)后產(chǎn)孢量變化基毒力測(cè)定

3 討論

紫外線誘變是一種作用時(shí)間長、效果好、設(shè)備簡單、對(duì)人體無傷害的誘變方法，其誘變效應(yīng)表現(xiàn)為：引起DNA的結(jié)構(gòu)改變，阻礙DNA的復(fù)制，或引起堿基排列次序的變化，從而引起基因突變。該方法是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的誘變方法之一。試驗(yàn)誘變獲得的403001-38菌株，在平板培養(yǎng)基上生長快，產(chǎn)孢時(shí)間（5～7 d）較普通白僵菌（10～15 d）大大縮短。

經(jīng)過10次繼代培養(yǎng)，誘變株403001-38表現(xiàn)比較穩(wěn)定，產(chǎn)孢量及其對(duì)2～3齡越冬代馬尾松毛蟲毒力一直高于出發(fā)菌株。但試驗(yàn)現(xiàn)象表明，多次繼代培養(yǎng)后，403001-38菌株顯示出菌苔變薄、表面有凹凸等現(xiàn)象。根據(jù)蔡國貴[9]的觀點(diǎn)，即在擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)必須選用含蛋白胨和蟲尸的培養(yǎng)基，在保證403001-38菌株培養(yǎng)性狀穩(wěn)定的前提下，本研究下一步的工作重點(diǎn)為403001-38菌株抗紫外線能力、耐熱性、儲(chǔ)存活力等生物學(xué)特性測(cè)定，及其在林區(qū)應(yīng)用時(shí)對(duì)馬尾松毛蟲的防治效果。

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