紫外誘變選育球孢白僵菌高產菌株

靳 磊，賀月林，劉 紅，王 震

（湖南省微生物研究所，湖南 長沙 410009）

化學農藥的大量使用給環境帶來了嚴重污染，隨著人類可持續發展戰略的提出，蟲生真菌在害蟲的持續控制及維護生物多樣性方面所發揮的作用越來越受到人們的關注。目前，在農林害蟲生物防治方面，真菌是研究、生產和應用最多的生物類群之一。其中，球孢白僵菌（Beauveria bassiana Vuillemin）是一類廣譜性昆蟲病原真菌，研究表明，此菌能侵染15個目149科的700多種昆蟲[1-3]。在我國，球孢白僵菌廣泛應用于桃小食心蟲、馬尾松毛蟲和玉米螟等害蟲的防治[4-8]。

然而，在我國白僵菌的工業化生產過程中，存在產孢量少、產孢周期長等不利因素。因此，通過菌種誘變選育來提高生產菌株的產孢量，對提高白僵菌工業化生產效率有著重要的意義。本實驗選用一種效果好、設備簡單、對人體無傷害的紫外誘變方法，對球孢白僵菌進行紫外誘變以獲得高產菌株，再進行繼代培養，最終得到產孢量大，生長速度快、致病能力強、遺傳性狀穩定的優良菌株，以供工業化生產所需。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 球孢白僵菌403001：由中國工業微生物菌種保藏中心購買，湖南省微生物所菌種保藏室保藏。

1.1.2 培養基 斜面培養基（PDA）。稱取去皮馬鈴薯200 g。切成小塊，加1000 mL水，煮沸1 h，用雙層紗布濾成清液，加瓊脂2%，用0.4 mol/L乳酸調pH為5.7。平板分離培養基：同上。

1.1.3 試驗用蟲 2～3齡越冬代馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus），取自湖南省森林植物公園。

1.2 實驗方法

1.2.1 產孢量測定 以50 μL微量注射器將菌株以107個/mL的孢子懸浮液接種到鋪有玻璃紙的平皿上，培養7 d。洗下玻璃紙上的全部孢子，血球計數板計數，取3次計數平均值。

1.2.2 誘變劑量的確定 取濃度為107個/mL球孢白僵菌孢子懸浮液5 mL，加入φ 90 mm的無菌培養皿中，先預熱紫外燈30 min，然后開啟平皿蓋于磁力攪拌下分別處理 5、10、15、20、25、30 min（15 W，30 cm），然后稀釋至10-6倍，分別吸取后3個稀釋度的孢子懸浮液各0.2 mL涂布平板培養6～7 d，計算致死率（紫外誘變致死的孢子數與未經誘變總孢子數的比值）和正突變率（產孢量超過出發菌株403001兩倍為正突變的菌落，正突變的菌株與總菌株個數的比值稱正突變率），以致死率70%～80%、正突變率最高為最適劑量。

1.2.3 致病力測定 用原菌株和篩選出的突變菌株，制成107個/mL濃度的孢子液，用喉頭噴霧器對2～3齡越冬代馬尾松毛蟲定量噴霧。每株菌5個重復，每重復10條蟲，對照組噴無菌水。馬尾松毛蟲接種后放在玻璃瓶內，用松針飼養，紗布封口，灑水保濕，25℃下每天更換新鮮松針，同時檢出死蟲，將其保濕培養，觀察是否白僵菌感染致死，統計死亡率。

2 結果與分析

2.1 誘變劑量的確定

球孢白僵菌403001的孢子懸浮液經紫外照射不同時間后，取樣稀釋，涂布于固體培養基上，每樣做3皿，10 d后統計菌落數，取平均值計算誘變致死率，并用孢子計數法檢測產孢能力，計算正突變率，誘變時間與致死率和正突變率之間的關系見圖1。

圖1 誘變時間對致死率和正突變率的影響

由圖1可知，隨著紫外線照射時間的延長，孢子的死亡率逐漸提高，在20 min之前正突變率隨著時間的延長而提高，但繼續照射，正突變率降低；在20 min時，正突變率最高，達32.2%。因此，選擇20 min為最佳的誘變時間。

2.2 突變株初篩

出發菌株403001經紫外誘變20 min后，稀釋并涂布到PDA培養基上培養，得到46個單菌落（表1），其中有15株正突變，31株負突變，正突變率為32.6%。

2.3 優良突變株篩選

對紫外誘變后產孢量高于出發菌株2倍以上的突變株進行繼代培養，繼續觀察產孢量和產孢特性的穩定程度（表2）。經半年4次繼代培養，403001的突變株中，仍有6株的產孢量高于出發株產孢量2倍以上，只有3株的產孢量低于出發株。

對保持較高產孢量的突變株403001-1、403001-22、403001-35和403001-38繼代培養至第10代，以第一代403001菌株為空白對照，將以上4株突變株對2～3齡越冬代馬尾松毛蟲進行毒力測定。結果（表3）表明，突變株403001-38培養性狀最為穩定，繼代培養10代后，對2～3齡越冬代馬尾松毛蟲的致死率為72%，為出發菌株403001的2.1倍。

表1 紫外誘變后得到的單菌落產孢量變化情況

表2 繼代培養后突變菌株產孢量測定

表3 正突變株繼代培養后產孢量變化基毒力測定

3 討論

紫外線誘變是一種作用時間長、效果好、設備簡單、對人體無傷害的誘變方法，其誘變效應表現為：引起DNA的結構改變，阻礙DNA的復制，或引起堿基排列次序的變化，從而引起基因突變。該方法是工業生產中最常用的誘變方法之一。試驗誘變獲得的403001-38菌株，在平板培養基上生長快，產孢時間（5～7 d）較普通白僵菌（10～15 d）大大縮短。

經過10次繼代培養，誘變株403001-38表現比較穩定，產孢量及其對2～3齡越冬代馬尾松毛蟲毒力一直高于出發菌株。但試驗現象表明，多次繼代培養后，403001-38菌株顯示出菌苔變薄、表面有凹凸等現象。根據蔡國貴[9]的觀點，即在擴大培養時必須選用含蛋白胨和蟲尸的培養基，在保證403001-38菌株培養性狀穩定的前提下，本研究下一步的工作重點為403001-38菌株抗紫外線能力、耐熱性、儲存活力等生物學特性測定，及其在林區應用時對馬尾松毛蟲的防治效果。

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