蹄葉橐吾組織培養及快速繁殖技術研究

高國超，黃 楠，廖 萍，徐 娜，姜長陽

（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連 116029）

蹄葉橐吾（Ligularia fischeri）又稱山紫苑、葫蘆七、荷葉七、硬紫苑、馬蹄紫苑、土紫苑和水荷葉等，屬于菊科橐吾屬多年生草本植物[1]，生長于濕地、山坡草地、河岸、灌叢和林下，在我國，主要分布在東北、華北等地，在遼寧的撫順、清原、寬甸、桓仁、岫巖、本溪、瓦房店、普蘭店等地有種植[2]。蹄葉橐吾的根和根莖含有倍半萜類化合物[3-6]，具有祛痰止咳、活血止疼、補虛潤肺等功效，能治咳嗽、痰多、咽痛、咳血、肺結核、勞傷、跌打損傷等疾病[6]。由于蹄葉橐吾具有重要的藥用價值。多年來，人們一直大量的采挖作為藥材，這使本來分布和數量較少的野生蹄葉橐吾越來越少。蹄葉橐吾利用種子繁殖較難，人工種植難度大。為了開發利用蹄葉橐吾這一寶貴資源，解決種植所需種苗問題，人們試圖探討無性系組培技術應用的可能性。雖然目前國內已有蹄葉橐吾組織培養研究的報道[7-8]，但迄今未見有關蹄葉橐吾快速繁殖研究的報道，為此對蹄葉橐吾的組織培養及快速繁殖技術進行了研究，以期為蹄葉橐吾大量種植提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

五月中旬，于普蘭店老帽山采集生長旺盛的蹄葉橐吾嫩莖，放入磨口廣口瓶中，進行消毒滅菌。其方法詳見參考文獻9。

1.2 方法

1.2.1 培養條件 詳見參考文獻9。

1.2.2 嫩莖愈傷組織的誘導培養 將蹄葉橐吾嫩莖切成約0.2～0.3 cm的莖段，接種到含不同濃度激素的MS培養基，在黑暗的條件下進行嫩莖愈傷組織的誘導培養。

1.2.3 分化培養 將繼代培養的愈傷組織分散為獨立顆粒后，接種到以MS為基本培養基，附加不同濃度激素的培養基上，在光照的條件下進行愈傷組織的分化培養。

1.2.4 試管苗生根培養 將繼代培養生長旺盛的不定苗，從基部剪下，接種到以MS、1/2MS、1/4MS、LS、B5、white、N6為基本培養基，分別附加IAA 0.1 mg/L、IBA 0.1 mg/L、NAA 0.1 mg/L、2，4-D 0.1 mg/L的生根培養基上進行生根培養。生根試驗重復2次，每種培養基接種培養100個不定芽。

1.2.5 試管苗的移栽與定植 將培養試管苗的培養瓶移到溫室中，打開瓶塞，放到較強的光照下煉苗3 d后，把試管苗從培養瓶中取出，移栽到上面鋪有一層厚5～7 cm爐灰渣苗的床上。并保持溫度15℃以上、濕度90%左右、沒有直射光照的環境條件。移栽試驗重復2次，每次移栽800株試管苗。把在溫室中，5月中旬把移栽成活的試管苗定植到大連郊區水庫邊的濕地上。定植試驗重復2次，每次移栽700株試管苗。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對莖段愈傷組織誘導的影響

莖段接種培養后10 d左右，有的切口張裂，長出淡黃色的愈傷組織，繼續培養到50 d時觀察，統計結果見表1：在BA濃度為1.5 mg/L時，不論與哪種生長素配合使用，均不易誘導形成愈傷組織。在BA濃度為0.9 mg/L時，雖然都能誘導形成愈傷組織，但誘導率較低。而在BA濃度為0.3 mg/L時，不論是含有不同濃度的NAA，還是含有不同濃度的2，4-D，愈傷組織的誘導率都較高。尤其是在2，4-D濃度為1.5 mg/L的培養基上，不僅愈傷組織的誘導率為82%，而且外觀上長勢較好。觀察還發現，在BA濃度為0.3 mg/L、2，4-D濃度為1.5 mg/L的培養基上，培養到50 d時，所誘導培養出的愈傷組織大小為0.2 cm左右的淡黃色顆粒狀。一般認為，這樣的愈傷組織為具有分化力的愈傷組織[10]。把這種培養基誘導培養的愈傷組織接種到相同的培養基上進行繼代培養，連續繼代培養5代，不僅培養的愈傷組織外觀上不變，而且生長速度加快，每個繼代周期為40 d，顆粒狀愈傷組織的增殖率達到了12.4倍。這說明MS+BA 0.3 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L的這一培養基是蹄葉橐吾嫩莖愈傷組織誘導培養的理想培養基。

表1 不同激素配比對愈傷組織誘導的影響

2.2 不同激素配比對愈傷組織分化培養的影響

接種后10 d有的培養基上開始分化出不定芽，繼續培養到45 d時觀察統計。結果見表2，在BA含量為0.6 mg/L，NAA含量為0.1 mg/L的培養基上，不僅愈傷組織顆粒分化率達94%，而且外觀上長勢好。在此培養基上培養20 d左右，在先已分化芽的芽基部，相繼分化出多個不定芽，培養到45 d時，就會分化出帶有3～7個不定芽組成的為叢生狀不定芽。把分化的不定芽從基部剪下后，接種到相同培養基上進行繼代培養，經過40 d培養，繼代的不定芽很快就又分化出生長較為旺盛的叢生不定芽，平均單芽的增殖系數為6.2個。經過連續5次的繼代培養，其分化率基本不變，但繼代培養的不定芽的長勢遠比直接由愈傷組織分化的不定芽旺盛，幾乎沒有無效不定芽。這說明MS+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L這一培養基是蹄葉橐吾愈傷組織和不定芽分化培養的理想培養基。

表2 不同激素配比對愈傷組織分化的影響

2.3 不同培養基及不同濃度激素對生根培養的影響

接種培養到8 d時，有的培養不定芽基部能形成根原基，30 d時觀察統計，結果證明：1/2MS+IAA 0.1 mg/L這一培養基的生根效果最好，不僅生根率達到了95.5%，而且試管苗長勢好。2次重復試驗的結果基本一致。由此證明：1/2MS+IAA 0.1 mg/L這一培養基是蹄葉橐吾生根培養的理想培養基。

2.4 生根試管苗的移栽與扦插

觀察表明，移栽后15 d可見成活的試管苗開始生長。30 d時平均移栽成活率為94.6%。定植后30 d平均成活率為98.6%。定植的試管苗初期生長較慢，植株較小，40 d后生長速度加快。7月上旬，與野生的蹄葉橐吾相比，試管苗具有植株整齊、葉色濃綠、根系發達等特點。同時，試管苗保持了野生蹄葉橐吾的所有生物學特性，8月下旬開花，9月下旬果實成熟。

3 討論

本研究對愈傷組織進行繼代培養，40 d為一個培養周期，愈傷組織的增殖率為12.4倍。按此速度，一年能繁殖出12.49個后代；對不定芽進行繼代培養，40 d為一個培養周期，不定芽的增殖系數為6.2個。按此速度，一年能繁殖出6.29個后代。僅從數量上看，后者遠不及前者，但是由于后者分化的不定芽幾乎都是有效不定芽，并且長勢旺盛，這更有利于進行生根培養。所以，從加快試管苗生長和更有利于快速繁殖的角度看，應該采用不定芽分化繼代培養的方法進行快速繁殖。

在愈傷組織分化培養中，其培養周期為45 d；而在不定芽分化繼代培養中，其培養周期為40 d。后者的培養周期比前者縮短了5 d。產生這種現象的原因有三：一是由于不定芽本身儲藏的營養比愈傷組織多，更有利于不定芽的分化；二是不定芽本身具有綠葉、綠色嫩莖等器官，在培養中能合成IAA等植物生長調節劑，有利于對自身生長分化的調節，促進了不定芽的分化；三是兩者都是在相同的培養基上進行分化培養的，前者是初代培養，需要一個適應過程，而后者是在前者的基礎上進行的，對培養基具有更強的適應性。

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