骨碎補藥材HPLC指紋圖譜與鑒別

朱國嬋 李建明 邱連建 曾斌

骨碎補(Rhizoma Drynariae)名貴中藥材，是我院中藥制劑常用的中藥材，市售骨碎補藥材有12種之多［1］。本實驗研究以抽皮苷和新北美圣草苷為對照品，對10批不同產地的骨碎補藥材進行測定，初步建立了HPLC指紋圖譜，并進行方法學的考察，標出8個共有指紋峰，借此指紋圖譜鑒定市售骨碎補藥材的真假。

1 儀器與試藥

2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)。柚皮苷對照品(批號:110722-201002，中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。)新北美圣草苷(沈陽藥科大學藥學院提供純度98%以上)。甲醇為色譜純、乙醇、磷酸分析純，實驗用水(雙蒸水)。10批骨碎補藥材正品分別購自全國各地(見表1)，經廣州中醫藥大學中藥學院張丹雁教授鑒定。另外，廣州市清平街市購買五個不同產地的骨碎補藥材作鑒別。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備 分別精密稱取干燥抽皮苷對照品和新北美圣草苷對照品5 mg和15 mg，分別置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并加至刻度，即得。精密稱取骨碎補藥材干粉1.0 g，置園底燒瓶加甲醇40 ml，熱回流3 h，冷卻后用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液置50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱:Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-0.1% 磷酸水(B)，二元梯度洗脫，洗脫程序:A:0 min 0%，5 min 5%，30 min 30%，45 min 50%，55 min 60%，70 min 50%;柱溫 28℃，流速:1 ml/min，檢測波長為283 nm。在此色譜條件下骨碎補的各色譜峰能較好分離，見圖1。

圖1 骨碎補HPLC指紋圖譜

2.3 樣品中主成分含量的測定

2.3.1 標準曲線繪制 分別精密吸取抽皮苷和新北美圣草苷對照品溶液 0.50、2.5、5.0、10、20、30 μl進樣，按 2.2 色譜條件測定各自峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制各自標準曲線。結果:得回歸方程:Y抽=789.66 X抽+1234.09，γ 抽 ＞0.9988;Y 新 =665.33 X 新 +2244.16，γ 新＞0.9966。抽皮苷在0.05～3.00μg，新北美圣草苷在0.15～9.00μg進樣量與峰面積均呈良好的線性關系。

2.3.2 樣品含量測定 精密吸取上述對照品溶液和上述10批樣品的供試品溶液各10 μl，分別按照2.2色譜條件測定其各自峰面積，按2.3.1標準曲線計算，即得。詳見表1。

表1 10批不同來源骨碎補藥材中抽皮苷及主要成分含量測定結果

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取上述產地骨碎補中同一份供試品溶液連續進樣6次，每次10ul，結果各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，相似度＞0.9978，RSD＜1.8%，表明使用儀器精密度良好。

2.4.2 重現性試驗 取上述產地骨碎補中某一樣品藥材5份，分別制備供試品溶液，分別依法測定，結果各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，相似度＞0.9566，RSD＜2.0%，表明方法的重現性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取上述某一供試品溶液，分別在制備后0、6、12、24、48 h進樣測定，結果指紋峰的相對保留時間和相對峰面積亦基本一致，相似度＞0.9788，RSD＜2.0%，表明樣品溶液在48 h內穩定。

2.5 HPLC指紋圖譜的構建

2.5.1 共有指紋峰的標定 按照文獻［2］規定，以抽皮苷為參照物(S1)將各色譜峰保留時間與S1的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間。分別計算，經過對照比較，其中8個色譜峰為槲蕨共有，相對保留時間為:，峰1(0.5287)，峰2(0.5411)，峰 3(0.6199)，峰 4(0.7455)，峰 5(0.8506)，峰6(0.9108)，峰7(1.0000)，峰 8(1.06891)為新北美圣草苷為參照物(S2)。因此標定它們為共有指紋峰見圖2和圖1。

圖2 10批骨碎補藥材的HPLC指紋圖譜

2.5.2 共有指紋峰的相對峰面積 根據參考文獻［2］和《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》把所有的峰面積全部標定并計算，各共有峰的相對峰面積依次為0.2729(1)、0.2144(2)、0.0209(3)、0.0398(4)、0.0158(5)、0.0188(6)、1.0000(S1)、0.9768(8)。(即 S2 新北美圣草苷)。其中 1、2、8 的峰面積均超過7號峰(抽皮苷峰)的10%。詳見圖1。這就作為定性鑒別骨碎補的依據。

2.6 廣州外買五批骨碎補藥材的鑒別 分別取五批外買供試品細粉各1.0 g，精密稱定，按“2.1”條制備供試品溶液，在“2.2”色譜條件下測定其指紋圖譜，見圖3。

圖3 五個不同來源骨碎補的HPLC指紋圖譜比較

3 討論

本文建立了骨碎補中藥材HPLC指紋圖譜，與文獻［1，3］報導用幾種不同色譜條件建立的指紋圖譜相比，共有指紋峰均為8個，反映的化學成分信息相當。經對照品比較，確定7號峰為抽皮苷(S1)、8 號峰為新北美圣草苷(S2)，1、2、3、4、5、6均為骨碎補藥材的有效化學成分。本文把它當作骨碎補藥材指紋圖譜的共有模式(圖2)，并把它作為定性定量檢測鑒定骨碎補藥材的真假，評價其外在內在質量的依據。

廣州市清平街市購買的五批骨碎補藥材，經本骨碎補藥材的HPLC指紋圖譜(圖2)比較鑒別，其中四批為非正品，因為共有指紋峰數不符，A、B、C各指紋峰的相對保留時間和峰面積無法匹配，更無法評價其相似度，其中D產品9個共有指紋峰中有7個可匹配，但其各峰相似度均小于0.7，所以為非正品。E產品8個共有指紋峰的相對保留時間和峰面積與(圖2)可以匹配，其相似度大于0.9。而且抽皮苷含量0.74%，新北美圣草苷含量0.55%，即其主成分含量1.29%，在指紋圖譜共有模式的測定范圍之內。被認定為骨碎補正品。這比上世紀末骨碎補類生藥商品調查使用的性狀鑒定或顯微鑒定研究方法先進、科學、準確、快速。與熊明玲［4］報導一致，但色譜條件不同其指紋圖譜各異。

［1］劉惠平，劉曼，李超，李發美.骨碎補藥材的高效液相指紋圖譜.沈陽藥科大學報，2008，25(2):133-136.

［2］ 蔡寶昌，劉訓紅.常用中藥材HPLC指紋圖譜測定技術.北京，化學工業出版社，2005:22-25.

［3］李順祥，張志光，龍勉，等.骨碎補超微飲片的HPLC指紋圖譜研究.中草藥，2005，36(11):1634-1637.

［4］熊明玲，劉凱南，高厚明，劉紀青.骨碎補高效液相指紋圖譜的構建與應用.中國藥業，2011，20(5):4-6.