拮抗細(xì)菌Bs-0728對(duì)板藍(lán)根根腐病的防治作用

高琳娜， 曹克強(qiáng)， 段英姿， 王樹桐＊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071001； 2.唐山師范學(xué)院生物科學(xué)技術(shù)系，唐山 063000）

拮抗細(xì)菌Bs-0728對(duì)板藍(lán)根根腐病的防治作用

高琳娜1， 曹克強(qiáng)1， 段英姿2， 王樹桐1＊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071001； 2.唐山師范學(xué)院生物科學(xué)技術(shù)系，唐山 063000）

［目的］篩選對(duì)板藍(lán)根根腐病有較強(qiáng)拮抗作用的生防菌株。［方法］采用平板對(duì)峙法對(duì)137個(gè)板藍(lán)根根際土壤樣本中分離到的201株拮抗細(xì)菌進(jìn)行測(cè)試。［結(jié)果］篩選出1個(gè)對(duì)板藍(lán)根根腐病菌有強(qiáng)烈抑制作用的菌株Bs-0728。結(jié)合顯微鏡觀察確定Bs-0728菌株對(duì)板藍(lán)根根腐病的主要致病菌茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)畸形，彎曲，部分細(xì)胞膨大。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，Bs-0728的發(fā)酵液田間防效達(dá)72.97%，且增產(chǎn)86.26%。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)及16SrDNA序列分析，初步將此拮抗細(xì)菌鑒定為枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis。［結(jié)論］枯草芽孢桿菌Bs-0728菌株是一株很有應(yīng)用前景的生防菌株。

拮抗細(xì)菌； 枯草芽胞桿菌； 板藍(lán)根根腐病； 茄腐鐮刀菌； 生物防治

板藍(lán)根根腐病近年來在一些板藍(lán)根主產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，成為板藍(lán)根生產(chǎn)的限制因素之一［1］。目前對(duì)板藍(lán)根根腐病的研究還很少，生產(chǎn)上主要采用播種前用多菌靈等殺菌劑進(jìn)行土壤處理加以控制。在前期研究中，本研究組對(duì)唐山市玉田縣板藍(lán)根根腐病的病原菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茄腐鐮刀菌是引起板藍(lán)根根腐病的主要致病菌。由于中藥材生產(chǎn)的特殊性，化學(xué)農(nóng)藥的使用必須受到嚴(yán)格的限制，而且，由于防治板藍(lán)根根腐病施藥主要以土壤施藥為主，容易造成水土污染。因此，近年來利用拮抗微生物防治中藥材根腐病正日益成為研究的重點(diǎn)［2－3］。

本研究組從全國(guó)板藍(lán)根主產(chǎn)區(qū)采集的137個(gè)根際土壤樣品中分離獲得了201株細(xì)菌，并以茄腐鐮刀菌Fs-P4菌株作為試驗(yàn)靶標(biāo)進(jìn)行了室內(nèi)拮抗作用測(cè)試，篩選得到了3株拮抗作用顯著的菌株，并對(duì)拮抗作用最強(qiáng)的Bs-0728菌株開展了系統(tǒng)的室內(nèi)拮抗作用及田間防治效果測(cè)試，明確了該菌株的生防效果，并采用形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察、生理及生化測(cè)定和16SrDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行了種類鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

拮抗細(xì)菌菌株Bs-0728，分離自唐山市玉田縣同仁堂板藍(lán)根生產(chǎn)基地土壤，茄腐鐮刀菌菌株Fs-P4，分離自唐山市玉田縣同仁堂板藍(lán)根生產(chǎn)基地罹病板藍(lán)根。

1.2 拮抗細(xì)菌的分離和篩選

從全國(guó)板藍(lán)根產(chǎn)區(qū)采集了137個(gè)土壤樣品，采用平板稀釋法進(jìn)行細(xì)菌分離。用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行了皿內(nèi)拮抗作用測(cè)試［4］。將培養(yǎng)4d左右的茄腐鐮刀菌從菌落邊緣打取直徑為6.0mm的菌餅，分別將其移接到直徑為9.0cm的馬鈴薯葡萄糖平板（PDA）中央，然后，在距平板中心點(diǎn)2.5cm處接種取自LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h的供試細(xì)菌5μL，使2滴菌液與病原菌菌餅3點(diǎn)保持在同一條直線上，24℃黑暗條件下對(duì)峙培養(yǎng)，設(shè)不接細(xì)菌的處理為對(duì)照，每重復(fù)3皿，本試驗(yàn)共重復(fù)3次。3d左右測(cè)量2滴菌液間病原菌的直徑，計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)率。

1.3 Bs-0728菌株對(duì)茄腐鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響

從對(duì)峙培養(yǎng)4d后的平板中，挑取與Bs-0728菌體接觸的病原真菌菌絲，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。

1.4 拮抗微生物防治板藍(lán)根根腐病的田間試驗(yàn)

試驗(yàn)在河北省唐山市玉田縣北京同仁堂藥材基地進(jìn)行。供試地塊屬壤土，肥力均勻，種植板藍(lán)根3年以上，歷年有根腐病發(fā)生。試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理，A：再植對(duì)照，當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)栽培管理；B：拮抗菌株Bs-0728發(fā)酵液100倍稀釋；C：50%多菌靈500倍稀釋。以上處理均采用灌根法施用。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積為3.0m×6.0m。每處理4次重復(fù)。5月15日、6月15日和7月15日，按小區(qū)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行灌根施藥處理。再植對(duì)照用等量清水灌根。9月29日進(jìn)行抽樣測(cè)產(chǎn)，參照文獻(xiàn)［5］調(diào)查病害嚴(yán)重度，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定

按照常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法［6－7］進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、芽胞染色及生理生化測(cè)定。測(cè)試的生理生化指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)性、接觸酶、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V.P.試驗(yàn)）、明膠液化、淀粉水解、糖類發(fā)酵產(chǎn)硫化氫、硫酸鹽還原、利用丙二酸鹽、生長(zhǎng)溫度、耐鹽性和需鹽性等。

1.5.2 16SrDNA序列測(cè)定與分析

采用細(xì)菌單菌落直接PCR擴(kuò)增法制備細(xì)菌DNA［8］。根據(jù)不同種屬細(xì)菌的16SrDNA序列兩端的 保 守 性 設(shè) 計(jì) 引 物［9－10］，63F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，引物1492R：ACGGTTACCTTGTTACGACTT，反應(yīng)體系50μL。反應(yīng)條件：94℃變性30s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)前預(yù)變性（94℃）5min，循環(huán)結(jié)束后延伸（72℃）10min。PCR產(chǎn)物用硅膠模型TMPCR產(chǎn)物（DNA片段）純化試劑盒（北京賽百勝基因技術(shù)有限公司）進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化［11］。純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板上篩選，挑取細(xì)菌菌落進(jìn)行LB液體培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)篩選出重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司做雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／blast）進(jìn)行同源性比較，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST檢索已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrDNA序列，采用ClustalX 2.0對(duì)16SrDNA序列片段進(jìn)行比對(duì)，利用Bootstrap N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用 Mega 4.1軟件顯示系統(tǒng)樹［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選結(jié)果

通過稀釋平板法共分離純化獲得201株拮抗微生物，其中9%的菌株抑菌率低于30%；32.5%的菌株抑菌率在30%～50%之間；其余58.5%的菌株抑菌率大于50%。將抑菌率大于50%的菌株轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，復(fù)篩，對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果獲得3株強(qiáng)抑制作用的拮抗細(xì)菌。其中，Bs-0728菌株培養(yǎng)3d后對(duì)茄腐鐮刀菌的抑制率為55.93%。鏡檢抑菌帶邊緣靶標(biāo)菌菌絲，菌絲表現(xiàn)異常，受抑制菌絲生長(zhǎng)畸形，菌絲多有卷曲，部分菌絲細(xì)胞膨大（圖1）。

圖1 Bs-0728對(duì)茄腐鐮刀菌的抑制作用

2.2 Bs-0728菌株對(duì)板藍(lán)根根腐病的防治效果

拮抗細(xì)菌菌株Bs-0728發(fā)酵液灌根處理板藍(lán)根，對(duì)板藍(lán)根根腐病具有較好的防治效果，防病效果達(dá)72.97%，與化學(xué)農(nóng)藥多菌靈處理無顯著差異。而且Bs-0728菌株有較強(qiáng)的增產(chǎn)效果，較再植對(duì)照產(chǎn)量增加86.26%，而多菌靈處理產(chǎn)量只增加了35.24%（表1）。

表1 Bs-0728菌株對(duì)板藍(lán)根根腐病的防治效果

2.3 菌株Bs-0728的種類鑒定

2.3.1 菌株Bs-0728的生理生化特性測(cè)定

Bs-0728的菌體大小為（0.6～0.8）μm×（2.8～3.4）μm。革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀，產(chǎn)芽胞，好氧性。菌落在LB固體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)性狀為：粉紅色，不透明，菌落菱形，邊緣不規(guī)則呈花朵狀，中間皺褶突起，呈放射狀。菌體形態(tài)及芽胞照片見圖2，生理生化特性見表2。按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《芽孢桿菌屬》的檢索表檢索，將菌株Bs-0728初步鑒定為枯草芽胞桿菌菌株。

2.3.2 Bs-0728的16SrDNA測(cè)序分析

Bs-0728的16SrDNA序列長(zhǎng)為1 585bp。將該序列在GenBank進(jìn)行BLAST同源序列檢索并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果Bs-0728菌株與枯草芽胞桿菌菌株BSD-2（Bacillus subtilis）（登錄號(hào)為 EF5234－74）位于同一個(gè)分支（圖3），同源性達(dá)到了99.9%。

圖2 Bs-0728菌體形態(tài)

3 結(jié)論與討論

中藥材的根腐病是生產(chǎn)種植中普遍發(fā)生的一種土傳病害，病原繁殖傳播迅速，危害極大，多年來化學(xué)農(nóng)藥防治不僅效果差，且極易污染土壤環(huán)境，而且增加了中藥農(nóng)藥殘留超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。利用生物防治，不但能防病增產(chǎn)，且能保護(hù)生態(tài)環(huán)境［13］。本研究通過對(duì)201株分離自各地土壤細(xì)菌的室內(nèi)篩選，發(fā)現(xiàn)菌株Bs-0728對(duì)板藍(lán)根根腐病菌的抑制作用最強(qiáng)。通過形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)以及16SrDNA序列分析，最終將Bs-0728鑒定為枯草芽胞桿菌［Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn］。

枯草芽胞桿菌是自然界廣泛存在的、對(duì)人畜無毒無害、不污染環(huán)境、對(duì)許多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物。能夠產(chǎn)生豐富的抗菌物質(zhì)，如脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類和核酸類等，對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒和菌原體等具有良好的抑制作用，同時(shí)，它又能產(chǎn)生生長(zhǎng)激素類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，因此，枯草芽胞桿菌已成為目前生物農(nóng)藥中研究最多的一種微生物［14－15］。

本研究分別在2008年和2009年開展了2次田間試驗(yàn)，2008年的試驗(yàn)因田間自然發(fā)病率偏低，導(dǎo)致Bs-0728的防病效果不夠突出。但其表現(xiàn)出了良好的促產(chǎn)效果，較對(duì)照增產(chǎn)47.03%。本文中所列為2009年田間試驗(yàn)結(jié)果。Bs-0728在2009年的田間防效高達(dá)72.97%，且增產(chǎn)86.26%，是一株很有應(yīng)用前景的生防菌株。在田間試驗(yàn)中，本研究使用的LB培養(yǎng)基發(fā)酵液作為試驗(yàn)材料，價(jià)格相對(duì)較高。為了能夠在更大的范圍內(nèi)推廣使用該菌株，應(yīng)進(jìn)一步篩選發(fā)酵培養(yǎng)基，并建立適宜的發(fā)酵培養(yǎng)條件，以提高該菌株的防效，并降低使用成本。

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Biocontrol ofIsatis indigoticaroot rot by the bacterial strain Bs-0728

Gao Linna1， Cao Keqiang1， Duan Yingzi2， Wang Shutong1
（1.College of Plant Protection，Agricultural University of Hebei，Baoding071001；2.Department of Biological Science and Technology，Tangshan Normal College，Tangshan063000，China）

［Objective］To screen effective antagonistic bacterium toIsatis indigoticaroot rot.［Method］Dural culture was conducted to test the antagonism of 201 bacterial strains isolated from137I.indigoticarhizosphere soil samples.［Result］The bacterial strain Bs-0728 showed the highest antagonistic effect against the majorIsatisroot rot pathogenFusarium solani.Bs-0728 was highly inhibitory toF.solaniby making the mycelia swollen and curly.Treated with fermentation broth of Bs-0728 in field trials，the disease control efficacy reached 72.97%，and the yield ofI.indigoticaroot increased by 86.26%compared with the untreated control.Identification by morphological observations，physiological and biochemical determination，and 16S rDNA sequence analysis showed that the strain belonged toBacillus subtilis.［Conclusion］The stain Bs-0728is a promising biological strain for application.

antagonistic bacterium；Bacillus subtilis；Isatis indigoticaroot rot；Fusarium solani； biocontrol

S 435.672

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.017

2010-08-26

2010-09-28

河北省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（2006432）；唐山師范學(xué)院科研項(xiàng)目（04c10）

＊ 通信作者 E-mail：bdstwang＠163.com