浙江溫嶺帕金森病線粒體DNA基因突變與多態性研究

周辰珩， 金 瑩， 洪 慶， 蔡海波， 臧秋玲

帕金森病(PD)是以震顫、強直、運動減少三大癥狀為臨床表現的嚴重危害中老年人的神經系統變性疾病，其病因及發病機制至今尚未清楚。據報道線粒體功能紊亂與PD發病有關，環境中的有害化學物質可能通過抑制線粒體中電子轉移系統中的復合物Ⅰ而影響PD的發病［1］。目前圍繞其病因的爭論很多，其中線粒體功能與PD的相關性研究是近年來研究的熱點，本文針對編碼線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ基因的3個位點突變進行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取我院神經內科門診散發性帕金森病患者88例，男性48例，女性40例，年齡44～78歲，平均(60.3±11.2)歲，符合英國帕金森病學會腦庫的帕金森病臨床診斷標準［2］。選取60例中老年健康體檢者，男32例，女28例，無高血壓，糖尿病病史，年齡46～76歲，平均(62.0±9.5)歲。兩組的年齡、性別差異無顯著性。

1.2 儀器和試劑

Bio-RAD My cyclerTM PCR儀(伯樂公司，美國);Bio-Rad Gel Doc 2000D凝膠成像儀(伯樂公司，美國);2720 Thermal Cycler PCR儀(ABI公司，美國);YY-6C型電泳儀(六一儀器廠，北京);5418型離心機(Eppendorf公司，德國);2×PCR mixture(Tiangen公司，瑞士);Maker(Ferments公司，德國);膠回收純化試劑盒(AXYGEN公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 DNA樣品制備 用酚/氯仿抽提法從研究對象外周靜脈血白細胞中提取基因組DNA。

1.3.2 PCR引物設計與合成 引物由上海生工合成，引物設計參考文獻［3］，見表1。

表1 三對線粒體NDA突變位點的PCR引物信息

1.3.3 PCR擴增 以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系總量25ml:上下游引物各 1.5ml，基因組 DNA 8ml，PCR mixture4μl，ddH2O10μl。PCR 條件:95℃預變性 5min，94℃變性30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸 40s，循環數為 35 個，72℃延伸10min，10℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并在自動凝膠成像系統上觀察擴增結果。

1.3.4 DNA測序 PCR產物的純化和測序由上海桑尼生物科技有限公司完成。其步驟如下:AXYGEN回收試劑盒純化PCR擴增產物并進行定量;以BigDye Terminator V3.1測序試劑盒對純化PCR產物進行處理，然后在ABI3730XL測序儀上進行正反向測序;拼接序列繪制出測序結果，并定位分析線粒體DNA 3個位點附近的堿基改變。

1.4 統計學方法

采用SPSS11.0軟件進行統計處理，統計分析應用χ2檢驗，P＜0.05差異有顯著意義。

2 結果

2.1 PCR 擴增

對G1719A、G4580A、C7028T 3個線粒體基因進行PCR擴增，在2%瓊脂糖凝膠中可見產物條帶都位于200bp。見圖1。

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 PD基因突變分析

對21例異常基因位點進行DNA測序，未發現這3個基因位點突變，反而在其附近發現多個位點突變，在G1719A附近有4例1711(G→A)1738(A→G)，3例 1738(A→G)，1例 1664(G→A)突變;在G4580A附近有1例4476(A→G)，1例4638(A→G)，1例4651(－→T)突變;在 C7028T附近有1例6984(C→T)，1例 6979(G→C)6984(C→T)，3例7083(C→ －)，4例6963(G→A)，1例6910(C→A)突變。對照組無發現突變位點。

2.3 突變類型測序

11種突變類型測序結果見圖2～圖4。G1719A附近基因位點突變測序圖譜(見圖2):1711(G→A)1738(A→G)，1738(A→G)，1664(G→A);G4580A附近基因位點突變測序圖譜(見圖3):4476(A→G)，4638(A→G)，4651(－→T);C7028T處基因位點突變測序圖譜(見圖4):6984(C→T)，6910(C→A)，6963(G→A)，7083(C→ －)，6979(G→C)6984(C→T)。

3 討論

帕金森病是一種常見的晚發性神經退行性病變，病理變化以中腦黑質部位多巴胺神經元的死亡和路易體的形成為特征。PD神經元死亡的主要形式是細胞凋亡，在細胞凋亡過程中線粒體起著中心調控作用。

最近幾年，遺傳和流行病學方面的證據表明，大多數PD患者為散發性，PD來自母系遺傳，提出線粒體基因組的改變可能是PD發病的根源［4］。mtDNA是獨立與核染色體NDA以外的基因組，其基因產物均直接或間接與細胞的氧化和磷酸化有關，氧化磷酸化是腦細胞能量的主要來源，在調節細胞內鈣穩態和細胞生存/死亡中起關鍵作用，有關線粒體DNA增殖的機制:一是可能存在代謝反饋系統，細胞通過刺激線粒體增殖代償減少氧化磷酸化能力;另外一個可能是野生型線粒體DNA順式控制作用，由于基因突變被抑制或失活，突變型線粒體DNA的量超過野生型，導致與細胞能量及代謝需要無關的突變型過度增加［5］。mtDNA的突變能影響與呼吸鏈有關的酶和氧化磷酸化過程，造成線粒體氧化磷酸化功能障礙，而且mtDNA突變引起電子傳遞鏈的功能缺陷增加線粒體中反應性氧自由基的生成，形成反應性氧自由基的惡性循環，同時，線粒體功能失調，能量不足，引起多巴胺神經元細胞死亡，組織細胞退行性病變，最終導致PD的發病［4～6］。本研究發現的多個mtNDA位點的突變也可能經過上述的機制造成PD的發病。

圖2 G1719A處基因位點突變測序圖譜

圖3 G4580A處基因位點突變測序圖譜

圖4 C7028T處基因位點突變測序圖譜

本研究針對文獻報道與PD有關的編碼呼吸鏈酶復合體Ⅰ基因位點G1719A、G4580A、C7028T進行基因PCR擴增，同時對21例異常基因位點進行DNA測序，并沒有發現這3個基因位點的突變，反而在其附近發現了多個位點的突變，共發現11種突變類型，對照組無發現突變位點，預示患者的線粒體功能受損，這可能與這些位點的突變率低、個體異質性以及地域差異等有關，這與蔣義國等［6］的研究結果類似。本研究盡管發現了PD患者mtNDA的多個位點突變，但不能肯定這些位點的突變對于PD具有臨床或病理意義，因為我們不知道其究竟是同義突變還是錯義突變，有待繼續深入研究。

［1］ van der Walt JM，Nicodemus KK，Martin ER，et al.Mitochondrial polymorphisms significantly reduce the risk of Parkinson disease［J］.Am JHum Genet，2003，72:804 －811.

［2］ Litvan I，Bhatia KP，Burn D J，et al.SIC task force appraisal of clinical diagnostic criteria for Parkinsonian disorders［J］.Mov Disord，2003，18(5):467 －472.

［3］ 王學波，李建遠.人線粒體DNA熒光定量PCR檢測方法的建立［J］. 生物醫學工程研究，2008，27(4):298 －301.

［4］ Shih CM，Ko WC，Wu JS，et al.Mediating of caspase-independent apoptosis by cadmium through the mitochondria-ROSpathway in MRC-5 fibroblasts［J］.JCell Biochem，2004，91(2):384 －397.

［5］ 季米娜，竇宵云，譚建強，等.帕金森病與線粒體的相關性研究進展［J］. 廣西醫學，2007，29(5):729 －731.

［6］ 蔣義國，Tammy Ellis，周蘭蘭，等.帕金森病相關的線粒體多態性基因型分析［J］.環境與健康雜志，2007，24(6):409－411.