靜脈注射骨髓基質細胞對大鼠局灶性腦缺血區域ICAM-1表達的影響

范 斌， 何志義

腦梗死發病率，致殘率高，且近年來呈逐漸上升的趨勢。目前除成人卒中急性期溶栓治療外，其他治療都局限于支持治療，不能阻斷腦損傷的發生或誘導腦組織的再生。近年來的研究證明骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作為一種非造血干細胞，具有自我更新、多向分化潛能，在特定的條件下能夠向神經細胞分化，分泌多種神經生長因子、保護因子，具有神經保護作用［1］。本實驗擬采用骨髓基質細胞治療大鼠局限性腦缺血，并觀察對大鼠細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級，2月齡，Wistar大鼠45只(由中國醫科大學動物部提供)，體重280～300g雌雄不限，隨機將大鼠分為正常對照組、鹽水對照組、股靜脈注射骨髓基質細胞組，每組動物15只，每組又隨機分為缺血再灌注3d、7d、14d 3個亞組，每組動物5只。另取1只Wistar大鼠，用于骨髓基質細胞分離培養，在實驗過程中對動物的處理符合動物倫理學標準。小鼠抗 BrdU，兔抗大鼠ICAM-1抗體，生物素標記羊抗兔IgG抗體，生物素標記羊抗小鼠抗體(武漢博士德公司);顯微照相儀(Olypus BX，51，Japan);圖像處理軟件包(Metamorph imagin system V4.6，USA)。

1.2 大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制作 采用改良Longa栓線法。以10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔麻醉大鼠，做頸部正中切口，分離左頸總動脈后穿一根4號縫線，繼續分離頸內、頸外動脈，結扎頸總、頸外動脈，用動脈夾夾閉頸總動脈遠心端，在其動脈夾遠端和結扎之間用1ml注射針頭將頸總動脈扎一小眼，將事先準備好的魚線穿人(魚線為5cm長，在2.0cm處做一標記，尖端用砂紙磨光滑)，松開動脈夾，調整魚線的角度和方向插入頸內動脈，測量魚線尾側距離動脈分叉處的距離，便可知插入的深度(應為1.8～2.0cm)，用縫線將魚線固定。全部大鼠統一采用栓死左側大腦中動脈并于梗死后1h再灌注。

1.3 骨髓基質細胞的分離培養及BrdU標記取2個月齡Wistar大鼠1只，腹腔注射5-氟尿嘧啶(150m/kg)，殺死部分外周血細胞，促進骨髓增殖，48h后將大鼠處死，無菌條件下，取股骨、脛骨用FBS液清洗干凈，除去股骨近端和脛骨遠端，除去另一端骨垢，用大號針頭在骨端生長面開一個小孔，用注射器將DMEM-LG培養液注入，收集沖洗出來的骨髓，打散組織成為細胞懸液，離心用DMEM-LG培養液重新懸浮沉淀的細胞，吹散后計數，按1×107接種于10%FBSw完全培養基的75cm2培養瓶中，于37℃5%二氧化碳及飽和溫度下培養。24h后換液去除未貼壁細胞。以后每3d換液1次，20d左右待后代培養的細胞增殖到80%時胰酶消化傳代，取第8代之前的細胞，在接種前1d以終濃度0.1mmol/L的溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine BrdU)標記。接種時，制成單細胞懸液，細胞密度3×106/ml。

1.4 骨髓基質細胞移植 在大鼠栓塞24h，大鼠隨機分組，治療組(n=15)每只大鼠股靜脈注射1ml 3×109的骨髓基質細胞;鹽水對照組(n=15)每只大鼠股靜脈注射1ml的生理鹽水;正常對照組(n=15)每只大鼠栓塞24h。

1.5 免疫細胞化學方法鑒定骨髓基質細胞用0.2%胰酶消化傳代培養的骨髓基質細胞使之成為單細胞懸液，接種于蓋玻片上培養過夜。次日用4%多聚甲醛固定20min，滴加血清封閉液10min，滴加一抗 CD34，CD44，CD106，37℃，60min，滴加生物素標記第二抗體37℃，10min，滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化酶37℃，20min，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水透明封片鏡檢。

1.6 神經功能損害評分 采用Chen等［2］報道的神經功能損害評分表(Neurological Severity Scores，NSS)，分別于移植前，移植后 3、7、14d 進行神經功能缺陷評分。分值越高代表損傷越重，評分8～12的大鼠納入實驗。

1.7 免疫組化染色 大鼠麻醉后(量同前)，劍突下剪開充分暴露心臟，6號輸液器刺入左心室，剪開右心耳，輸入250ml生理鹽水，之后輸入250ml 4%多聚甲醛固定。然后斷頭取腦，腦組織去掉額極和尾極，放在固定液中儲存3d，以備做免疫組化分析。免疫組化采用SABC法。試劑來自武漢博士德公司。取出鼠腦切片，常規脫蠟脫水，新鮮配置3%H2O2室溫10min，切片浸0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰斷電，間隔5min，甩去多余液體。一抗為兔抗大鼠ICAM-1單克隆抗體及兔抗大鼠BrdU抗體，工作濃度(1∶100)，購于武漢博士德公司，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，按說明逐步操作。切片在顯微照相儀下照相(Olypus BX，51，Japan)，由圖像處理軟件包量化(Metamorph imagin system V4.6，USA)。照相部位取梗死周圍皮質。

2 結果

2.1 靜脈移植骨髓基質細胞后 骨髓基質細胞可在缺血半球大量存活，在対側半球也有少量存活。BrdU免疫組織化學染色結果提示，在梗死半球可見大量BrdU陽性細胞，絕大部分分布在梗死灶周圍，対側半球也可見少量BrdU陽性細胞。

2.2 靜脈移植骨髓基質細胞顯著改善大鼠神經功能評分 造模后3、7、14d分別對各組大鼠進行神經功能損傷評分并進行統計學分析，結果發現正常對照組及生理鹽水組在各時間點，大鼠神經功能評分無顯著性差異(P＞0.05)，骨髓基質細胞移植組在各時間點，神經功能評分均顯著低于正常對照組及生理鹽水組(P＜0.05)。并且組內比較，在14d骨髓基質細胞移植組神經功能評分顯著低于同組3d及7d的神經功能評分(P＜0.05)(見表1)。

2.3 靜脈移植骨髓基質細胞顯著抑制梗死區ICAM-1的表達 缺血后，正常對照組及生理鹽水組ICAM-1蛋白表達水平顯著升高，但在缺血后各時間點，兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。骨髓基質細胞組ICAM-1表達水平經方差分析在缺血后3d、7d較正常對照組及生理鹽水組顯著降低(P＜0.05)。14d較對照組及生理鹽水組無顯著性差異(P＞0.05)(見表2、圖2)。

表1 靜脈注射BMSCs對MACO大鼠神經功能缺陷評分的影響

表2 免疫組化檢測術后不同時間點ICAM-1的表達(平均灰度值)

圖1 梗死半球BrdU陽性細胞(×400)

圖2 免疫組化檢測術后不同時間點ICAM-1的表達(×400)

3 討論

我們的研究結果提示，骨髓基質細胞可通過股靜脈進入缺血的腦組織中，這些移植的骨髓基質細胞可以存活，絕大部分分布在梗死灶內及周邊帶并在對側大腦半球及紋狀體有少量表達。并可以顯著改善腦梗死所造成的神經功能缺損，最重要的是我們的研究首次發現靜脈移植骨髓基質細胞可以顯著抑制ICAM-1的表達。

MSCs是骨髓內造血干細胞以外的非造血干細胞，通常也被稱作骨髓間質干細胞、骨髓祖細胞等。MSCs在體外和體內具有多向分化潛能。特定誘導環境下MSCs可以向骨、軟骨、心肌、神經元等多胚層方向分化［3］。在合適的培養條件下MSC可以在體外長期傳代、大量擴增，而細胞生物學特性沒有明顯改變。

我們的實驗中用免疫化學方法鑒定骨髓基質細胞，結果:CD34(－);CD44(+);CD106(－);CD34是造血細胞特異性標志，主要分布于T B細胞，單核細胞及前體細胞的表面，骨髓基質細胞沒有表達。CD44及CD106在骨髓來源的骨髓基質細胞及造血干細胞均陽性表達，因此骨髓基質細胞的特征為CD34(－);CD44(+);CD106(+)。

我們的結果提示靜脈移植骨髓基質細胞后，骨髓基質細胞可在缺血半球大量存活，在對側半球也有少量存活。局灶性腦缺血時，由于血腦屏障的破壞，可能有助于MSCs選擇性遷入缺血腦區。此外，缺血腦組織的炎癥等缺血相關信號也可能誘導和促進MSCs的遷移。Wang等［4］研究發現，單核細胞趨化因子(MCP-1)水平有助于MSc向缺血腦組織遷移。

本研究表明通過靜脈注射骨髓基質細胞可以顯著改善腦梗死所造成的神經功能缺損。那么是什么機制或因素使移植的骨髓基質細胞改善大腦的神經功能，降低腦梗死的體積?目前考慮可能的作用機制為:(1)骨髓基質細胞滲透至缺血腦組織部位，替代受損的神經元細胞，重塑神經傳導通路。(2)傳導通路的重建并不是神經功能恢復的必要條件，更合理的解釋是移植的骨髓基質細胞除可以分泌NGF、VEGF、BDNF、bFGF、HGF、CSF-1 等多種生長因子;還可分泌 IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15等重要的細胞因子［5］;骨髓基質細胞還可以合成膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘蛋白等細胞外基質［6，7］。這些神經營養和保護因子可能通過不同的機制，在半暗區起著神經保護作用，減少神經元凋亡。近年來的大量研究證明腦梗死是一個炎性反應的過程，對腦內炎癥反應及其干預措施的研究成為腦梗死病理、生理和防治研究的熱點。白細胞的黏附在缺血/再灌注損傷中起重要作用，在此過程中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)起核心作用，因此在本研究中，我們檢測了靜脈移植骨髓基質細胞對ICAM-1表達的影響。ICAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，在體內分布較廣。在正常情況下ICAM-1在腦組織中僅有少量表達，在腦組織受損如缺血、創傷及炎癥時，在內毒素及一些細胞因子，如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素等刺激下，其表達明顯升高［8］。ICAM-1和其配體白細胞功能相關抗原LFA-1結合后能夠介導白細胞與靶細胞黏附，促使白細胞向缺血區聚集和浸潤，這些聚集和浸潤的白細胞不僅能夠直接阻斷微血管，而且還能產生縮血管物質，引起血管收縮，降低血流量加重腦缺血，同時還可以釋放自由基、蛋白水解酶等細胞毒性物質，導致缺血細胞進一步損傷［9，10］。最近，Soriano等［11］發現，能表達ICAM-1的野生型小鼠腦組織梗死體積是不能表達ICAM-1的純合子小鼠腦組織梗死體積的5.6～7.8倍。應用ICAM-1抗體亦能證實ICAM-1和白細胞在缺血腦損傷中的作用。Zhang等［12］觀察了大鼠短暫性大腦中動脈閉塞時缺血區ICAM-1單克隆抗體的作用。結果表明，應用ICAM-1抗體組梗死體積較對照組縮小41%，白細胞的數量也顯著減少。缺血早期應用ICAM-1抗體治療還可以延長(t-PA)溶栓治療的時間窗。這說明ICAM-1是介導缺血再灌注損傷的關鍵因子，抑制其異常表達，可以有效的阻斷白細胞和血管內皮細胞間的粘附過程，從而減輕再灌注的損傷程度。

本研究發現生理鹽水組與正常對照組之間，缺血后各時間點均見ICAM-1表達明顯上調，但兩組間無顯著性差異。這與 Vemuganti等［13］的研究相一致，說明腦梗死后存在炎癥反應。注射骨髓基質細胞組ICAM-1的表達水平經方差分析在3d、7d較對照組和生理鹽水組顯著降低。說明通過靜脈移植骨髓基質細胞可以顯著抑制ICAM-1的表達，從而阻斷細胞間的粘附，改善缺血再灌注損傷的程度，達到保護腦組織，治療腦梗死的目的。

ICAM-1的表達是可以誘導的。核轉錄因子NF-κB、IL-1、TNF-α 可以誘導 ICAM-1 的表達［14～16］。我們推測靜脈移植骨髓基質細胞可以改善腦缺血局部的微環境，抑制炎癥反應的發生，從而抑制ICAM-1的表達。這值得進一步研究。

綜上所述，我們的研究結果提示:靜脈注射骨髓基質細胞治療大鼠局限性腦梗死，可以改善大鼠神經功能評分，降低腦梗死體積，抑制ICAM-1的表達，從而保護腦神經細胞，減輕缺血再灌注的損害。為更好的應用于臨床還有以下問題需進一步研究:(1)經靜脈注射的骨髓基質細胞遷移入腦內的方式途徑及其分子機制，如何提高骨髓基質細胞進入腦內的數量。(2)骨髓基質細胞移植是否也存在治療時間窗。(3)骨髓基質細胞移植治療局灶性腦缺血的生物安全性，有必要進行廣泛、深入的基礎研究。總之靜脈移植骨髓基質細胞治療大鼠局限性腦梗死可能為臨床治療缺血性腦梗死開辟了一條新的途徑。

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