金雀異黃素在不同鈣濃度條件下對大鼠血管平滑肌cGMP水平的調節作用

于桂春， 孫莉娜， 周珊珊， 林靜涵， 張黎明

金雀異黃素是一種異黃酮類植物雌激素，其結構和雌激素相似，在大豆等植物中含量豐富，同時作為一種酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase，PTK)抑制劑，廣泛應用于各種研究。金雀異黃素不僅可以直接舒張血管，還可以抗動脈粥樣硬化、調整血脂、保護血管內皮、抑制血管平滑肌增殖、抗氧化等，對多系統具有保護作用，在心腦血管疾病的防治中有重要地位［1～4］。如研究發現，蛛網膜下腔出血后的嚴重并發癥——腦血管痙攣的主要發生機制之一即氧合血紅蛋白通過增強酪氨酸蛋白激酶活性引起血管持續收縮，金雀異黃素等PTK抑制劑可阻斷該效應［5］。另有研究表明，金雀異黃素抑制血管平滑肌細胞 L型鈣通道鈣離子內流，誘導血管舒張［6］。

cGMP是細胞內重要的第二信使，由血管平滑肌細胞可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)催化產生。在血管平滑肌細胞，cGMP一方面直接和間接抑制細胞膜電壓依賴鈣通道、促進肌漿網鈣攝取、增加內鈣外流，使細胞內鈣離子濃度下降，另一方面降低收縮裝置對鈣離子的敏感性，導致血管平滑肌舒張［7］。目前尚無文獻報道不同細胞外鈣濃度下金雀異黃素對血管平滑肌舒縮狀態的影響。本研究通過觀察金雀異黃素在不同鈣條件下對大鼠血管平滑肌cGMP含量的影響，從金雀異黃素和鈣的角度為藥物研發提供新的思路和理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

成年雄性SD大鼠8只，體重300±50g(購自哈爾濱醫科大學附屬第一醫院實驗動物中心)，按不同干預方式隨機分為8組，每組4只。cGMP酶免疫分析試劑盒(貨號581021)，購自美國 Cayman Chemical公司。金雀異黃素、二甲基亞砜、毒胡蘿卜素內酯、EGTA、硝苯地平、BAPTA-AM、NaCl、NaHCO3、葡萄糖、KCl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2均購自美國Sigma公司。水合氯醛、乙醚、三氯乙酸均為國產分析純。金雀異黃素用二甲基亞砜溶解配制，二甲基亞砜終濃度＜0.1%。

1.2 實驗方法

1.2.1 腸系膜動脈的分離 成年雄性SD大鼠禁食水8h后稱重，10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉。開腹，動脈夾在近心端夾閉腸系膜動脈，遠心端結扎，靠近結扎部位剪斷血管，將腸系膜與腸管分離。將得到的組織浸于持續通入95%O2+5%CO2的4℃ Krebs-Henseleit(K-H)緩沖液中，顯微鏡下分離腸系膜動脈血管。上述K-H液成分為(mmol/L):NaCl 130，NaHCO314.9，葡萄糖 5.5，KCl 4.7，KH2PO41.18，MgSO41.17，CaCl21.6，pH 7.2 ～7.4。

1.2.2 標本處理 每只大鼠分離得到的腸系膜動脈在通氧K-H液中平衡20min后，分為實驗組(金雀異黃素100μmol/L)和對照組，分別給予下述干預條件37℃ 孵育20min:鈣離子濃度為0、0.6、1.2、和 1.8mmol/L，EGTA 2mmol/L，硝 苯 地 平10μmol/L，毒胡蘿卜素內酯2μmol/L和BAPTA-AM 20μmol/L(n=4)。

1.2.3 cGMP測定 標本孵育結束后立即放入液氮中冷凍。組織稱重后加入預冷的5%三氯乙酸4℃下勻漿化，4℃下1500r/min離心10min，取上清液，沉淀烘干稱重。水飽和乙醚洗滌3次，以除去三氯乙酸。采用cGMP酶免疫分析試劑盒，嚴格按照說明書操作。組織cGMP含量以pmol/mg表示。

2 結果

2.1 不同鈣濃度下大鼠腸系膜動脈cGMP含量

實驗組 cGMP含量在低鈣濃度組(0、0.6、1.2mmol/L)較正常鈣濃度組(1.8 mmol/L)降低(P＜0.01)，隨鈣濃度降低而逐漸下降;對照組cGMP含量在低鈣組與正常鈣濃度組無明顯差異，然而，隨著鈣濃度逐漸降低cGMP水平則逐漸升高(見圖1)。

圖1 不同鈣濃度下cGMP水平

2.2 鈣螯合劑作用下大鼠腸系膜動脈cGMP含量

EGTA(2mmol/L)作用下，實驗組cGMP含量較EGTA對照組(5.13倍)和正常鈣條件實驗組(3.94倍)有顯著升高(P＜0.01)(見圖2)。BAPTA-AM(20μmol/L)作用下，實驗組cGMP含量與對照組無明顯差異，而較正常鈣條件實驗組降低(P＜0.01)(見圖3)。

圖2 不同鈣條件下cGMP水平

圖3 BAPTA-AM作用下cGMP水平

2.3 L型鈣通道阻斷劑和肌漿網鈣泵阻斷劑作用下大鼠腸系膜動脈cGMP含量

硝苯地平(10μmol/L)作用下，實驗組較硝苯地平對照組和正常鈣條件實驗組cGMP含量明顯升高(P＜0.01)。毒胡蘿卜素內酯(2μmol/L)作用下，實驗組較毒胡蘿卜素內酯對照組cGMP升高(P＜0.01)，與正常鈣條件實驗組相比cGMP含量降低(P ＜0.01)(見圖2)。

3 討論

cGMP是血管平滑肌細胞內重要的第二信使，由細胞內可溶性鳥苷酸環化酶催化產生。研究證明，cGMP通過抑制鈣內流、增加內鈣外流、促進肌漿網鈣攝取等來降低細胞內鈣濃度，并降低鈣敏感性，從而使血管平滑肌細胞舒張［7，8］。因此，血管平滑肌的cGMP水平可以在一定程度上反映其收縮舒張狀態。本實驗中正常鈣條件對照組cGMP含量0.088 ±0.032pmol/mg，這與 Cleber等［9］測定的大鼠腸系膜動脈環基礎條件下0.09±0.01pmol/mg一致。正常鈣條件下，加入100μmol/L金雀異黃素可使 cGMP 含量抬高至 0.681 ±0.010pmol/mg，與對照組值相比，cGMP含量顯著升高(P＜0.01)。當細胞外無鈣時，金雀異黃素可調節cGMP含量至0.146±0.040pmol/mg水平，低于對照組 0.256 ±0.054pmol/mg(P＜0.05)。這說明不同鈣濃度下金雀異黃素對血管平滑肌cGMP含量有不同的調節作用。

鈣離子作為底物協助促進鳥苷酸環化酶的催化活性，但表現為sGC的負性變構調節劑。文獻報道［10］，將大鼠sGC轉染入不表達一氧化氮合酶、本身sGC活性很低的人胚腎HEK293細胞，發現鈣離子抑制其sGC活性;Serfass等［11］也支持這一觀點。

本實驗中對照組cGMP含量在正常鈣濃度組和低鈣濃度組相比雖然無顯著差異，但可以看出，在正常細胞外鈣至零細胞外鈣水平之間，隨鈣濃度降低，cGMP含量逐漸升高。而金雀異黃素孵育20min后改變了此情況，實驗組cGMP含量低鈣濃度組較正常鈣濃度組降低(P＜0.01)，且隨鈣濃度降低逐漸下降。雖然實驗組低鈣濃度下cGMP含量低，但并不能因此推斷血管平滑肌舒張，因為低鈣濃度本身也會造成血管舒張。因此，我們將進一步利用血管張力實驗深入研究。

細胞內鈣離子濃度是調節血管平滑肌收縮的關鍵［7，12］。胞漿內鈣離子濃度升高或鈣敏感性增加，平滑肌細胞收縮;相反則平滑肌細胞舒張。細胞外鈣離子內流、肌漿網鈣釋放使胞漿鈣離子濃度升高，前者在血管平滑肌細胞主要通過細胞膜L型鈣通道流入，而Ca2+-ATP酶、Na+-Ca2+交換使鈣離子排出細胞外或重新進入肌漿網內，胞漿鈣離子濃度降低。

研究表明［6］，金雀異黃素對細胞膜L型鈣通道有抑制作用，在正常鈣條件下實驗組cGMP含量較對照組高(P＜0.01)，這可能與金雀異黃素抑制L型鈣通道有關，鈣離子內流減少，鈣離子對sGC的抑制作用下降，從而使cGMP含量增加。實驗組和對照組加入L型鈣通道阻斷劑硝苯地平(10μmol/L)后，對L型鈣通道的抑制作用更強，cGMP含量更高(P＜0.01)。而加入EGTA(2mmol/L)完全螯合細胞外鈣離子，使鈣內流進一步減少，實驗組cGMP含量達到最高。上述結果與鈣離子抑制sGC活性的觀點一致。但是為何在細胞外鈣為零時實驗組cGMP含量反而不高，還需要進一步的探索。

毒胡蘿卜素內酯能夠抑制肌漿網Ca2+-ATP酶活性，肌漿網鈣排空后不能回收，消除了內鈣釋放的影響，使細胞內鈣離子濃度降低。對照組加入毒胡蘿卜素內酯對結果無顯著影響，實驗組cGMP含量較正常該條件對照組下降。這與鈣離子抑制sGC的假說矛盾，但肌漿網排出鈣離子后胞漿內鈣離子濃度短暫上升，可能對結果也有影響。BAPTA-AM可螯合所有進入細胞內的鈣離子，無金雀異黃素存在時(即對照組)較正常鈣條件對照組cGMP含量升高，與鈣離子抑制sGC活性的觀點一致，實驗組與對照組無明顯差異，BAPTA-AM抹除了所有進入細胞內的鈣的影響，我們的結果提示金雀異黃素作用的最終通路在于細胞內鈣離子濃度的變化。

綜上所述，我們的結果顯示在不同鈣濃度條件下金雀異黃素對大鼠腸系膜動脈平滑肌的cGMP影響不同，隨細胞外鈣濃度下降 cGMP含量降低，EGTA、硝苯地平存在下金雀異黃素使cGMP含量明顯增加，毒胡蘿卜素內酯、BAPTA-AM存在下金雀異黃素使cGMP含量下降。不同鈣條件下金雀異黃素對血管平滑肌的舒縮影響及相應機制還有待更深入的研究。

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