23株HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者病毒的全基因組分析*

李志軍,蘇智軍,林成祖,郭如意,林萬松

2.福建醫科大學附屬泉州第一醫院感染病科,泉州362000;

3.福建醫科大學腫瘤微生物學福建省重點實驗室,福州350001

23株HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者病毒的全基因組分析*

李志軍1,蘇智軍2,林成祖2,郭如意2,林萬松3

目的研究HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者HBV變異特點。方法 PCR擴增并克隆HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者血清中HBV全基因組DNA,測序并進行基因結構分析。結果 獲得23株HBV全基因組DNA,它們均屬于C或B基因型。與中國HBV B、C基因型參照序列相比,HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者來源的HBV在表面抗原、P蛋白、X蛋白的反式激活區及增強子II/核心啟動子區發生了一些有意義的共有變異。結論 HBV變異可能與HBeAg陽性慢性乙型肝炎的發生、發展有關。

乙型肝炎病毒;基因變異;全基因組

2.福建醫科大學附屬泉州第一醫院感染病科,泉州362000;

3.福建醫科大學腫瘤微生物學福建省重點實驗室,福州350001

據WHO估計,全球大約有20億人感染了乙型肝炎病毒(HBV),約有3.5億人患有慢性感染[1]。我國是乙肝大國,HBV感染率為50.1%,乙肝表面抗原攜帶率約占總人口的7.18%,以此計算,全國約有9300萬人攜帶 HBV,其中乙肝患者大約有3000萬[2]。研究顯示,HBV一些特定位點的變異可以引起慢性乙型肝炎抗病毒治療的失敗。另外,由于大多數的研究是以HBV的部分片段或特定位點作為研究對象,并不能反映病人體內病毒的真實狀態,具有一定的局限性。為了更好的理解HBV的生物學特征,本文采用全基因克隆的方法,了解HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者HBV變異特點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 血清 標本來自福建醫科大學附屬泉州第一醫院11例和福州市傳染病院12例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者2006-2009年血清共23例。所有病例診斷按2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會西安會議修訂的病毒性肝炎防治方案診斷標準。

1.1.2 主要試劑 pSure-T載體購自北京博邁德科技發展有限公司,DH5α菌株購自Invitrogen公司,蛋白酶 K、酵母tRNA購自Sigma公司,限制性內切酶HindⅢ、T4 DNA ligase購自Biolab公司。Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity購自Ivitrogen公司,膠回收及質粒小量抽提試劑盒購自上海超世生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血清 HBV DNA 抽提 100 μ L血清加入300 μ L TES 液 (10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0,5 mmol/L EDTA,0.5%SDS,50μ g Protease K),混勻,65℃消化過夜,等體積苯酚/氯仿及氯仿抽提各1次,上清加入2倍體積無水乙醇、1/10體積3 mol/L醋酸鈉(pH 4.8)及20μ g酵母tRNA,DNA沉淀以70%乙醇漂洗1次并溶于50μ L滅菌雙蒸水中。

1.2.2 HBV DNA全基因擴增 引物參照Günther等方法[3]設計并改進,正向引物序列:5′CCCAAGCT TGAGCTCT TCT TT TTCACCTC TGCCTAATCA 3′, 反 向 引 物 序 列:5′CCCAAGCT TGAGCTCT TCAAAAAGTTGC ATGGTGCTGG 3′。PCR擴增條件:反應體積25μ L。各成分的終濃度為:2.5 mmol/L MgSO4,0.2 mmol/L dNTP,正反向引物各20pmol,lxPCR緩沖液,5 uL抽提HBV DNA,1U高保真DNA聚合酶。擴增采用熱啟動方式,即:反應先經預變性95℃3min,待溫度上升至80℃后加入T aq/pwo聚合酶,隨后進入循環。PCR擴增程序為:95℃40s,61℃1min,68℃3min(第 1-20循環);94℃40s,61℃1min,68℃3min(第21-35循環,引物延伸時間每循環遞增5s);最后68℃延伸10min。

1.2.3 PCR產物克隆及重組子的篩選 PCR產物回收后與pUC18在4℃連接16 h,轉化感受態大腸桿菌DH5α。在含氨芐青霉素及X-gal、IPTG平板上挑取白色菌落,堿裂解法抽提DNA,以HindⅢ酶切鑒定。

1.2.4 HBV DNA基因組序列測定 以ABI371型DNA自動熒光序列分析儀進行序列測定。所用測序引物包括pUC18通用引物及HBV DNA特異性引物。

1.2.5 HBV DNA及各編碼區氨基酸分析 基因型分析:采用Vector NTI 10.0分析軟件對所分離的HBV DNA通過序列比較進行基因型歸類,基因型分析采用的標準株為:基因型 A(X02763、X51970、AF090842),基 因 型 B (D00329、AF100309、AB033554),基因型 C(M12906、X04615、AB014381),基 因 型 D (X65259、AB048702、X85254),基因型 E(X75664、X75657、AB091256),基因型 F(AB036910、AF223965、X69789),基因型 G(AF160501、AB064310和AF223965),基因型 H(AY090454、AY090457 和AY090460)。實驗結果以中國HBV B、C基因型參照序列[4]為標準序列。

2 結 果

2.1 乙型肝炎病毒全基因組DNA擴增及克隆從23份HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者血清中擴增出3 215 bp的HBV全基因組。將HBV全基因組DNA通過T-A克隆至pSure-T載體,以ABI 3730XL全自動熒光序列分析儀進行序列測定。

2.2 基因型 以已知的標準A-H型HBV全基因組DNA為參照,以VectorNTI10.0軟件對所獲得的全基因組 HBV DNA進行基因型分析,結果顯示,在所獲得的23株HBV中,B基因型為12例,C基因型為11例。

2.3 乙型肝炎病毒各編碼區氨基酸及基因調控區變異 本研究的23例(B12,C11)血清標本中,與中國HBV B、C基因型參照序列相比,B基因型的主要變異位點分別位于:nt753T,nt1368A,nt1752G,nt2699G,nt2712T,nt3097C;C基因型的主要變異位點分別位于:nt31C,nt934C,nt1762T,nt1764A,nt2681G,nt2699G,nt3026C,nt3166C。

2.3.1 preS及S區氨基酸變異在preS1區,B基因型的HBV株在60位氨基酸發生A→V突變,C基因型的HBV株在84位氨基酸發生I→L突變見表1,在preS2區,雖然有核苷酸的變異,但卻沒有氨基酸突變。另外,HBV B基因型在S區第200位氨基酸發生F→Y變異。

2.3.2 P區氨基酸變異HBV B基因型在P區第136位氨基酸發生Y→H突變,此突變位于 TP區。C基因型在P區264位氨基酸發生P→H突變,此突變位于space區;在314位氨基酸發生P→S突變,位于逆轉錄酶(RT)區;另外,在615位氨基酸發生 L→I突變,位于RH 區。

2.3.3 增強子II/核心啟動子區變異 增強子II(1685-1773nt)和核心啟動子區(1742-1849nt)重疊區域有3個位點的氨基酸變異。分別為B基因型1752位核苷酸出現G→A變異,C基因型1762位核苷酸及1764位核苷酸分別出現出現T→A及A→G變異。

2.3.4 X區變異 X蛋白的編碼區(1374-1838nt)與增強子II/核心啟動子區交叉重疊。增強子II/核心啟動子區在1752、1762、1764位核苷酸的變異導致X蛋白在116、130、131位氨基酸發生變異。上述130、131位氨基酸發生變異位于X蛋白的反式激活區內(120-140aa)。

3 討 論

慢性乙型肝炎的發生過程是HBV與宿主細胞相互作用與共同演變的過程,HBV的生物學特性可顯著影響其致病過程。

慢性乙型肝炎病毒變異在不同地區存在很大差異,既有基因型間的差異,也有個別核苷酸位點的差異,我國流行株主要為B、C基因型。本研究獲得的23株HBV均為B或C基因型,與中國大陸慢性乙型肝炎的HBV基因型一致。HBV基因型與慢性乙型肝炎的關系有待進一步研究。

preS1區,B基因型60位氨基酸A→V突變位點、C基因型84位氨基酸I→突變位點為preS1抗體的結合區域(58-100aa)[5],該區域氨基酸變異可能影響病毒清除,與病毒的持續感染有關。研究結果顯示包膜蛋白變異位于已知的抗體結合區域或B/Th/Tc細胞表位內,提示HBV的免疫逃逸可能是乙型肝炎慢性化的原因之一。由于TP區與干擾素療效密切相關,因此P基因TP區多個位點的變異對干擾素治療的影響有待進一步研究;同樣位于RT、RH區的變異對慢性乙型肝炎的影響需要進一步加以研究。

1762位點A-T和1764位點G-A雙突變(A1762T,G1764A)為核心啟動子最常見的變異。核心啟動子區突變也能阻止HBeAg的產生,而不會影響HBV的復制或核心抗原的表達,只是選擇性下調前核心mRNA的轉錄,但不影響前基因組RNA[6]。且與前核心區變異不同,檢測發現核心啟動子變異在HBeAg陰性和HBeAg陽性患者中的比例類似[7]。本研究中,這些位點卻并沒有發生上述所說的變異,可能與所選病例都為 HBeAg陽性患者有關。

X蛋白可反式激活包括原癌基因在內的多種細胞及病毒基因[8],與肝癌的發生有關。由于X蛋白編碼區與增強子II及核心啟動子相重疊,增強子II及核心啟動子的核苷酸變異可引起相應位置X蛋白氨基酸的變異,本研究中130、131位氨基酸位于X蛋白的反式激活區,這些氨基酸變異與X蛋白的激活活性有待進一步研究。

[1]Ganem D,Prince A M.Hepatitis B virus infection-Natural history and clinical consequences[J].N Engl J M ed,2004,350:1118-1129.

[2]Liang X,Bi S,Yang W,et al.Epidemiological serosurvey of Hepatitis B in China-Declining HBV prevalence due to Hepatitis B vaccination[J].Vaccine,2009,27(47):6550-6657.

[3]Gunther S,Li BC,Miska S,et al.A noval method for efficient amplification of the whole hepatitis B virus genomes permits rapid functional analysis and reveals deletion mutations in immunosuppressed patients[J].J Virol,1995,69:5437-5444.

[4]吳光華,丁惠國,曾長青.公共核酸數據庫乙肝病毒全基因組序列概況和中國HBV參照序列的建立[J].自然科學進展,2008,18(2),121-129.

[5]Fiordalisi G,Ghiotto F,Castelnuovo F,et al.Analy sis of the hepatitis B virus genome and immune response in HBsAg,anti-HBs positive chronic hepatitis[J].J Hepat,1994,20:487-493.

[6]Buckwold VE,Xu Z,Chen M,et al.Effects of a naturally occurring mutation in the hepatitis B virus basal co re promoter on precore gene expression and viral replication[J].Virol,1996,70:5845-5851.

[7]Wang Y,Wei L,Jiang D,et al.In vitro resistance to interferonalpha of hepatitis B virus with basic core promoter double mutation[J].Antiviral Research,2007,75:139-145.

[8]Heermann K H,Goldmann U,Schwartz W,et al.Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-s sequence[J].J Virol,1984,52(2):396-402.

Structural analysis of 23 full-length hepatitis B virus genomes isolated from HBeAg positive chronic hepatitis B patients

LI Zhi-jun,SU Zhi-jun,LIN Cheng-zu,GUO Ru-yi,LIN Wan-song
(Department of Infectious Diseases,Quanzhou First Hospital Af filiated
toFujian Medical University,Quanzhou362000,China)

To study the characteristics of full-length Hepatitis B Virus(HBV)genomes isolated from HBeAg positive chronic hepatitis B(CHB)patients.Amplified the full-length HBV genomes by PCR from the serum of HBeAg positive CHB patients,sequenced and analyzed the structure of HBV genomes.Obtained twenty-three full-length HBV DNAs from the different CHB patients.Phylogenetic analysis revealed that all HBV strains could be categorized into genotype B or C.Structural analysis showed that,as compared to standard strains of Chinese HBV B、C subtypes,HBV obtained shared meaningful consensus mutations in B/T cell epitopes of surface and P protein,transactive domain of X protein and enhancer II/core promoter regions.Genotype and gene mutation of HBV may closely correlated with the carcinogenesis of HBV-related chronic hepatitis B.

Hepatitis B virus;full-length Gene mutation genomes

R373

A

1002-2694(2011)08-0728-03

*國家自然科學基金資助課題(30840069);2008年福建醫科大學科研項目資助課題(FZS08002)和2007年泉州市科技計劃項目資助課題(2007Z15)聯合資助

蘇智軍,Emial:su2366@sina.com

1.福州市第一醫院,福州 350001;

2011-02-17;

2011-06-12