量子點標記肺炎支原體重組蛋白抗體檢測抗原方法的建立*

曾晶晶,何夢博,趙芝娜,周世冠,王桂珍

量子點標記肺炎支原體重組蛋白抗體檢測抗原方法的建立*

曾晶晶,何夢博,趙芝娜,周世冠,王桂珍

目的建立一種用CdSe/ZnS量子點標記技術用于肺炎支原體檢測的方法。方法用重組Mp P1蛋白免疫動物制備免疫血清,硫酸銨沉淀法及離子層析法純化IgG抗體,純化抗體用CdSe/ZnS量子點標記,離心沉淀法純化標記產物。用標記抗體檢測Mp抗原。結果量子點標記抗體直接玻片熒光法檢測Mp抗原具有較高的敏感性(檢測靈敏度在0.001μ g/mL),且與呼吸道常見病原菌無交叉反應。結論成功建立量子點標記技術檢測肺炎支原體抗原方法,具有操作簡單、檢測快速的優良,適用于M p感染的早期診斷。

肺炎支原體;量子點標記技術;抗原檢測

近年來,量子點憑借其自身獨特的光譜特征和光化學穩定性越來越受到人們的重視。量子點(quantum dots,QDs)是一種半導體納米晶體,與傳統熒光染料相比,具有激發光譜寬、發射光譜窄、發光效率高,發光顏色可調,并且具有較高的熒光強度和光穩定性,能夠承受多次的激發和光發射等一系列優點[1-2],在實驗室診斷中有著廣泛的應用前景。

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)不僅引起急性呼吸道疾病,還引起其他多系統、多器官的肺外并發癥[3]。由于Mp無細胞壁,故其引起感染的治療與其它細菌和病毒感染在治療方法上有所不同。對Mp的實驗室診斷,支原體分離培養雖然是金標準,但其分離率低、時間長,成本高不適于臨床應用[4]、主要是通過血清學檢測和分子生物學[5]等方法,而這些方法存在著各自不同的優缺點,因此,到目前為止,國內外對Mp的實驗室診斷沒有統一的標準。本研究基于QDs標記技術,擬探討用量子點標記的重組Mp P1抗體檢測Mp抗原,建立一種新的檢測體系和方法,以期解決Mp感染的早期、快速診斷問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 Mp FH菌株、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌和乙型鏈球菌均為本實驗室保存菌種;P1重組蛋白為本實驗室制備;發射波長605nm的核殼型CdSe/Zns硒化鎘量子點,表面活性基團為羧基,購自武漢珈源量子點公司;弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司;1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購自上海生工;熒光分光光度計(HITACHI);熒光顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 兔源多抗的制備 P1重組蛋白的提取與純化參照文獻[6],純化的重組蛋白加等體積弗氏完全佐劑免疫家兔,多點皮下注射免疫,以弗氏不完全佐劑加強免疫3次后頸動脈采血獲得多抗血清,以ELISA法測定抗體效價。

1.2.2 IgG的提取純化 采集的免疫血清用硫酸銨沉淀法粗提免疫球蛋白,取免疫血清加入飽和(NH4)2SO4使其成20%溶液,以除去纖維蛋白。吸取離心上清加入飽和(NH4)2SO4使之成為50%溶液以除去白蛋白,再加入飽和(NH4)2SO4使其成33%溶液從而除去類球蛋白,沉淀溶于PBS中即為粗提Mp多克隆抗體。取NaOH處理后的DEAESephadex A-50裝柱,用0.01 mol/L PBS平衡至pH7.4后加入硫酸銨粗提免疫球蛋白,然后用洗脫液進行洗脫并分管收集,用紫外分光光度計測純化抗體的濃度。采用SDS-PAGE方法確定抗體純度。

1.2.3 抗體標記與純化[7]在1.5mL的微量離心管中加入50μ L的量子點(8.05μ mol/L),然后加入10μ LEDC(0.4mg)和 10 μ L sulfo-NHS(0.2mg),加磷酸鹽緩沖液補至800μ L,不停地混合溶液,室溫下反應20min。加入純化的抗體 200 μ L(5 mg/mL),37℃振蕩反應2 h。加入100 μ L甘氨酸(1 mol/L),封閉量子點上未反應的羧基。將偶聯反應所得到的產物4℃,12 000 r/min離心20 min,所得沉淀即為純化的偶聯有量子點的P1重組蛋白抗體。

1.2.4 量子點偶聯產物效果測定 偶聯產物熒光效率測定:用熒光分光光度計測定量子點標記的抗體,通過標記物熒光強度的測定,判定抗體-量子點的偶聯反應是否改變量子點的熒光效率。試驗所用激發光為488 nm,掃描605 nm的發射波譜。

偶聯產物的免疫反應性測定 取Mp全菌抗原2μ L滴于硝酸纖維素膜(NC膜)上,4℃干燥后用BSA-PBS 4℃封閉過夜。用PBS洗膜 3次,干燥后,在含有包被抗原處分別加入量子點偶聯-P1重組蛋白抗體、量子點、P1重組蛋白抗體和PBS反應。37℃作用2 h,反應后用PBS洗3次,在紫外燈下觀察結果。

1.2.5 量子點偶聯產物檢測Mp抗原 取Mp FH對數生長期培養物,12 000 r/min離心30min,棄上清,沉淀加入0.01 mol/L的PBS溶液,充分混勻,離心洗滌3次,收集沉淀反復凍融3次后,即為Mp菌體抗原,加入0.01 mol/L的PBS制備菌懸液,取5μ L菌懸液滴加于玻片上,室溫自然干燥,用-20℃預冷的丙酮固定。將1∶40稀釋的偶聯有P1重組蛋白多克隆抗體的量子點(0.4μ mol/L)滴加入上述抗原片上,于37℃濕盒中作用45 min,用 PBS洗滌3次,自然干燥,滴加堿性緩沖甘油,加蓋玻片封片,在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 敏感性試驗 將Mp菌體抗原依次稀釋為10 μ g/mL 、1 μ g/mL 、0.1 μ g/mL 、0.01 μ g/mL 、0.001 μ g/mL,固定其它條件,操作過程同 1.2.5,以PBS作空白對照進行檢測。

1.2.7 特異性試驗 分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌抗原按1.2.5操作,以PBS作空白對照進行檢測。

2 結 果

2.1 Mp P1重組蛋白免疫血清純化 ELISA方法測定P1免疫血清效價為1∶25 600,蛋白濃度為18.1 mg/mL,用飽和硫酸銨沉淀法后測得蛋白濃度為8.471 mg/mL,DEAE-Sephadex A-50離子交換層析法進行純化后的P1重組蛋白IgG濃度為3.68 9mg/mL。SDS-PAGE結果顯示見圖1,粗制免疫血清中含有多種蛋白組分,飽和硫酸銨沉淀純化的抗體仍有雜蛋白,而經過離子層析純化后的血清僅有1條帶,分子量為57kD與IgG重鏈分子量相符。

圖1 SDS-PAGE鑒定Mark:分子量標準;1:P1重組蛋白免疫血清;2:P1重組蛋白硫酸銨沉淀免疫血清;3:P1重組蛋白離子交換層析方法純化的血清Fig.1 Analysis of purified Mp IgG by SDS-PAGE

2.2 量子點偶聯產物效果測定結果:用Hitachi F-4500分光光度計選擇488nm激發波長測定標記產物。結果顯示,抗體與量子點的偶聯反應未改變量子點的發射波長的熒光效率。

偶聯產物的免疫反應性測定結果顯示,膜上滴加偶聯有量子點的P1重組蛋白抗體顯示較強的紅色熒光,而滴加量子點、P1重組蛋白抗體和PBS對照的位置無紅色熒光,如圖3。證明本實驗成功將量子點標記在P1重組蛋白抗體上,且被標記的P1重組蛋白抗體仍能與相應抗原分子特異性結合。

2.3 量子點偶聯產物檢測Mp抗原 含有有Mp菌體抗原部分呈現出橘黃色、邊界清晰的圓形顆粒,見圖4。隨著MP抗原濃度減少,出現的熒光點也隨之減少,其可以檢測到 0.01μ g/ml～0.001μ g/mL MP蛋白中的抗原,見圖5,表明有較高的敏感性。將標記抗體分別與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌抗原作用,由圖6所示,結果表明特異性較好。

圖4 ×1 000Fig.4 MP抗體顆粒

3 討 論

近十多年來,量子點熒光標記技術陸續在生物醫學領域中使用。早期研究主要集中于對細胞的免疫熒光標記成像。由于其具有高靈敏度、靶向、實時、原位、活體、多色、多功能示蹤等特性,近來被應用于病原學檢測及致病機制研究[8-9]。將量子點標記技術用于病原抗體檢測[10]及抗原檢測[11-12]的研究均有報道,結果顯示量子點偶聯抗體有較大的應用潛力,在實驗室診斷領域中也受到了人們廣泛的關注。

Mp感染廣泛存在于世界各地,可引起地區性流行。早期診斷、早期治療可明顯縮短Mp感染病程,建立有效、敏感的早期檢測方法是十分重要的。

本文利用交聯劑DEC和NHS,采用共價鍵連接的方法進行抗體的量子點標記。EDC和量子點表面的羧基反應生成?；愲?但?；愲逶谒芤褐腥菀姿?又生成羧基產物。在溶液中加入NHS,?；愲鍢O易和NHS反應,生成具有胺反應活性的NHS酯,其能與抗體表面的氨基反應生成穩定的酰胺而偶聯到抗體上。與傳統的抗體熒光素標記方法相比,量子點標記方法十分簡單,只需要簡單離心就可對標記產物純化。而傳統的抗體熒光素標記方法需要反應過夜,標記產物還需要透析法或層析法進行純化,整個過程耗時,且操作繁瑣。

本文應用量子點標記P1重組蛋白抗體用于Mp抗原的檢測,由于重組蛋白特異性高[7],本研究用其抗體以直接免疫熒光法檢測Mp抗原也顯示出高的特異性,與其他呼吸道常見菌無交叉反應。在預先完成量子點標記后,從處理標本到完成目標抗原檢測,用該方法檢測所需時間為45～60min,對Mp蛋白抗原檢測的靈敏度在0.001 μ g/mL,表明方法簡便、快速、敏感。由于感染后抗原出現時間早于抗體,因此可用于Mp感染的早期診斷。

本研究應用量子點標記技術建立的Mp抗原檢測方法,已經在實驗階段取得了比較理想的結果,不僅具有較高的靈敏度和很好的特異性,操作也更加簡便快速。本實驗組將會對該檢測體系和方法在臨床標本檢測中應用作進一步的研究和評價。

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Detection ofMycoplasma pneumoniaeby quantum dots label antibody

ZENG Jing-jing,HE Meng-bo,ZHAO Zhi-na,ZHOU Shi-guan,WANG Gui-zhen
(Departmentof Pathogenic biology,College of basic medical science,Chinamedical universtity,Shenyang110001,China)

A test method using quantum dots conjugation was developed for the detection ofM.pneumoniae.To obtain the anti-M p P1 polyclonal antibody,a rabbit was immunized with recombinantMpP1 antigens.The polyclonal antiserum was purified by ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.CdSe/ZnS quantum dots(QDs)was used to label rabit anti-recombinant P1 protein IgG,and the production was purified.M.pneumoniaewas successfully detected at the concentration as low as 0.001 g/mL.No crossreaction was observed when this system was used to detectM.pneumoniaeand other common bacteria.The QDs test method established in this study had been demonstrated to be a specific,sensitive and rapid for the diagnosis of mycoplasma,and it offers a promising possibility to be used in laboratory diagnosis.

M.pneumoniae;quantum dots;antigen detection

R374

A

1002-2694(2011)08-0704-04

*遼寧省教育廳基金項目(No.2004D226)資助

王桂珍,Email:gzw004@126.com

中國醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室,沈陽110001

2011-01-17;

2011-03-24