醫院感染銅綠假單胞菌β-內酰胺酶基因型分析

王 楊,高 輝,黃云昆,付曉野,徐 敏

(昆明市延安醫院檢驗科,云南昆明 650051）

銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa,PA）廣泛分布于自然界,屬于條件致病菌,在正常人體內很少致病,卻是醫院感染的重要病原菌之一。隨著新型廣譜抗菌藥物的廣泛應用,PA對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥性日益嚴重,限制了抗生素的選擇,給臨床抗感染治療帶來了極大的困擾。該研究收集臨床標本中分離的20株PA,通過研究其β-內酰胺酶基因型及耐藥性特點,為進一步研究昆明地區PA耐藥基因的分布情況奠定基礎,為減少耐藥PA的產生、提高臨床抗感染治療效果提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2009年6月-2009年10月昆明市延安醫院(三甲醫院）臨床標本中分離的非重復性PA20株。質控菌為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 藥敏紙片和培養基

16種藥敏紙片種類詳見藥敏結果表中所列,亞胺培南、美洛培南、環丙沙星、為英國Oxoid公司產品,其余藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術開發公司產品。藥敏試驗用M-H培養基,為英國Oxoid公司產品。

1.3 細菌鑒定與藥敏試驗

用法國生物梅里埃VITEK32細菌鑒定儀進行細菌鑒定,藥敏試驗采用K-B瓊脂擴散法,按美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS）的標準判讀藥敏試驗結果。

1.4 提取細菌基因組DNA

用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA,按試劑盒說明書操作,試劑盒由天根生物技術有限公司生產。

1.5 檢測β-內酰胺酶基因

用Biometra Personal Cycler PCR儀擴增7種β-內酰胺酶基因,PCR擴增引物由北京百泰克生物技術有限公司合成,7種靶基因引物序列見表1[1]。PCR擴增體系均為 :2 ×Taq Master Mix 25 μ L,模板 0.5 μ L,P1 引物2 μ L,P2 引物 2 μ L,無菌去離子水補足至50 μ L(Taq PCR MasterMix購自北京博邁德科技發展有限公司）。熱循環參數均為:94℃2 min,然后94℃60 s→55℃60 s→72℃60 s,循環35個周期,最后72℃10 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,Bio-Rad Laboratories 6000凝膠成像系統觀察結果,并攝像保存。

表1 PCR引物序列

1.6 基因序列測定與分析

β-內酰胺酶基因擴增的陽性產物經純化后,用ABI 377全自動DNA序列分析儀進行序列測定,所測序列用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST進行序列比對和同源性分析。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果

20株PA對16種抗菌藥物的敏感性,見表2。

2.2 β-內酰胺酶基因PCR檢測結果

20株PA均檢測出TEM 基因,而SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX-M-1基因擴增均為陰性。

2.3 序列分析及比對

本研究對6個菌株的TEM基因PCR陽性產物進行雙向測序,共測得523個核苷酸。該序列與β-內酰胺酶TEM-1的編碼基因(GenBank注冊號:NC013365.1）同源性為99%。

3 討論

PA是醫院感染的重要病原菌之一,其對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥性呈逐年上升趨勢。研究發現,PA對β-內酰胺類抗菌藥物產生耐藥的主要機制是細菌產生各種 β-內酰 胺酶(β-lactamases,BLA）,β-內酰胺酶基因可由質粒介導,通過轉化、轉導、結合、傳遞等方式在同種或不同種屬菌株間轉移和傳播,造成院內感染流行[2]。在各個國家和地區流行的BLA基因型各有不同[3-5]。

該研究中的20株PA均檢測出TEM-1型β-內酰胺酶基因,與國內其他地區的檢測結果有一定差別[6,7]。導致菌株β-內酰胺酶基因攜帶率不同的原因可能與菌株來源(地理位置）和各地區醫院抗菌藥物的使用習慣不同有關。TEM-1是革蘭陰性菌中最常見的一種廣譜β-內酰胺酶(SBL）,能水解青霉素和低代頭孢菌素如頭孢噻吩和頭孢噻啶等。在新一代抗生素選擇性壓力等因素的影響下,細菌的β-內酰胺酶基因突變,可由廣譜酶TEM-1、2發生1-5個氨基酸改變而衍生出超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs）,能水解廣譜青霉素、第三代頭孢類及單環類抗生素,目前已發現了160種TEM型衍生酶,呈酸性,等電點為5.2-6.5,其中大部分是ESBLs[8-11]。藥敏結果顯示本組PA對β-內酰胺類抗菌藥物都有不同程度的耐藥,尤其對氨曲南和頭孢哌酮的耐藥率更分別高達45%和75%,攜帶TEM-1基因可能是本組PA對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要原因之一。而昆明地區PA的β-內酰胺酶基因型除TEM-1型外,是否存在其它基因型別,其流行率如何,課題組正在進行深入研究。

此外,藥敏試驗顯示,該組PA不僅對β-內酰胺類藥物耐藥,對β-內酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類、磺胺類和喹諾酮類等其他抗菌藥物也存在很高的耐藥率。PA表現為多重耐藥,其機制非常復雜,研究發現細菌可通過基因變異或基因水平轉移獲得耐藥基因,除產生各種β-內酰胺酶,還可產生抗生素修飾酶、外排泵高表達、藥物作用靶位改變和外膜通透性改變等。PA對同一種類抗菌藥物的耐藥通常不是由單一因素造成的,而是幾種機制協同作用的結果,其對不同種類抗菌藥物的耐藥機制也各有不同,還不斷有新的耐藥機制出現,而且同一菌種在不同地區、不同時期其耐藥性和耐藥基因的攜帶狀況也不盡相同[12-15]。因此,檢測當地PA的耐藥率及耐藥基因流行情況,對于及時發現突變株,指導臨床合理使用抗生素,預防和控制感染具有重要意義。

[1]常 東,蔣 偉,魏 華,等.多重耐藥銅綠假單胞菌產超廣譜β-內酰胺酶基因研究[J].中華醫院感染學雜志,2006,16(9）:961.

[2]Bradford PA.Extended spectrumβ-lactamases in the 21st Century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].ClinMicrobiol Rev,2001,14(4）:933.

[3]Coque TM,OliverA,Perez JC,et al.Genes encoding TEM-4,SHV-2,and CTX-M-10 extended-spectrum beta-lactamases are carried by multiple Klebsiella pneumonise clones in a single hospital[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46:500.

[4]Radice M,Power P,Conza JD,et al.Early dissemination of CTX-M-derived enzymes in south America[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(2）:602.

[5]Munday CJ,Xiong J,Li C,et al.Dissemination of CTX-M type beta-lactamases in Enterobacteriaceae isolates in the People's Republic of China[J].Int J Antimicrob Agents,2004,23(2）:175.

[6]王春新,糜祖煌,黃支密,等.中國部分地區銅綠假單胞菌β-內酰胺酶基因型研究[J].中國抗生素雜志,2008,33(3）:164.

[7]陳賢君,李克誠,韓立中,等.產超廣譜β-內酰胺酶腸桿菌科細菌的基因型研究[J].檢驗醫學,2007,22(3）:283.

[8]鐘運華,何 林,周克元,等.超廣譜β-內酞胺酶研究進展[J].國際檢驗醫學雜志,2008,29(3）:252.

[9]張 玲,黃留玉.革蘭陰性桿菌產超廣譜β-內酰胺酶研究進展[J].中華醫院感染學雜志,2008,18(6）:897.

[10]Patricia A,Bradford.Extended spectrum β-Lactamases in the 21st century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].Clinical Microbiology Reviews,2001,14(4）:933.

[11]Varsha G.An update on newer β-lactamases[J].Indian J Med Res,2007,11:417.

[12]Zavasck AP,Carvalhaes CG,Picao RC,et al.Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii:resistance mechanisms and implications for therapy[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2010,8(1）:71.

[13]Poirell L,Weldhagen GF,Dechamps C,et al.A noso-comial outbreak of Pseudomonas aeruginosa isolates expressing the extended-spectrum betalactamase GES-2 in South Africa[J].J Antimicrob Chemother,2002,49(3）:561.

[14]Castanheira M,Toleman MA,Jones RP,et al.Molecular characterization of a β-lactamases gene,blagim-1,encoding a new subclass of metallo-βlactamases[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(12）:4564.

[15]Normark BH,Normark S.Evolution and spread of antibiotic resistance[J].J Intern Med,2002,252(2）:91.