四川漢族血小板獻(xiàn)血者HPA-9基因頻率調(diào)查

蒿廣德,劉 敏,齊文玲,蒲麗蓉

(廣元市第一人民醫(yī)院輸血科,四川廣元 628017）

隨著成分輸血的不斷深入推廣應(yīng)用,血小板輸血已成為臨床輸血治療的重要手段之一,在血小板質(zhì)量和數(shù)量存在問題的疾病治療中發(fā)揮了重要的作用。人類血小板同種抗原(human platelet alloantigens,HPA）位于血小板膜糖蛋白上,這些蛋白是由遺傳決定的,HPA的基因頻率在不同種族、不同區(qū)域中的分布是不同的。在臨床血小板輸血過程中,如果血小板同種抗原不相匹配[1],可導(dǎo)致受血者機(jī)體產(chǎn)生血小板同種抗體,引起同種免疫血小板減少綜合癥、輸血后紫癜、血小板輸注無效等。目前檢測出的24個HPA抗原中除HPA-14bw抗原是由于在核苷酸1901到1911位置上AAG等3個堿基缺失外,其他抗原均由于單核苷酸取代而產(chǎn)生。鑒于HPA在血小板輸血中的重要意義,現(xiàn)對四川省廣元市113名固定血小板獻(xiàn)血員HPA-9進(jìn)行基因分型,報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本收集128名四川省廣元市固定血小板獻(xiàn)血者,漢族,相互之間無血緣關(guān)系。采集每個血小板供者300 μ l全血,EDTA 抗凝 。

1.2 試劑與儀器設(shè)備Bio-RAD my cycler PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD,USA）,凝膠成像系統(tǒng)(UVP,USA）。

1.3 基因組DNA的提取按北京天根DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA,每份標(biāo)本溶解于30 μ l TB溶液中。

1.4 HPA-9基因分型HPA-9基因分型使用G&T公司試劑,HPA-9基因分型分為HPA-9a和HPA-9b基因檢測,內(nèi)對照是人類生長激素,產(chǎn)物大小為429 bp,HPA-9基因檢測產(chǎn)物大小為196 bp。HPA-9基因分型基因檢測根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無以及產(chǎn)物是否是預(yù)期大小一致的片段來判斷基因分型。根據(jù)說明書反應(yīng)體系為 10 μ l,引物混合物 7 μ l,DNA1 μ l(20-50 ng）,Taq酶1 μ l(0.25 u）。擴(kuò)增參數(shù):按94℃變性3 min;94℃,30 s、60℃,30 s、72℃,90 s;30 個循環(huán)后72℃延伸5 min;4℃循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增。

1.5 電泳擴(kuò)增結(jié)束后PCR產(chǎn)物 5 μ l在2%的瓊脂糖內(nèi)點(diǎn)樣,使用0.5×TBE緩沖液中150V電泳20 min結(jié)束電泳,凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計分析基因頻率是指一個群體中某類等位基因的數(shù)量占該基因位點(diǎn)上全部等位基因的比率。等位基因頻率f(a）=[2×純合子+雜合子]/[2×總個數(shù)],f(b）=1-f(a）;基因型頻率是指一個群體中某一基因型的個體占群體中全部個體的比率。不同國家和地區(qū)人群間基因頻率的比較采用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(精確概率法）,基因型之間的比較采用 χ2檢驗(yàn)的構(gòu)成比的比較。以P＜0.05為有差異,P＜0.01為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果調(diào)查的128名四川廣元漢族固定血小板供者基因分型結(jié)果全部是HPA-9aa,未檢測到HPA-9bw,調(diào)查人群基因型分布結(jié)果符合Hardy-Weinberg定律[2]。該地區(qū)HPA-9的基因頻率是1.0,HPA-9b的基因頻率是0,見表1。

2.2 四川廣元市漢族人群HPA-9基因頻率與不同國家和地區(qū)人群調(diào)查比較 四川廣元市漢族人群HPA-9基因頻率與高加索人、臺灣地區(qū)、上海漢族、濰坊漢族及邯鄲漢族地區(qū)比較的結(jié)果P＞0.900[3-7],不存在差異,見表2。根據(jù)目前報道HPA-9基因分布呈單態(tài)性。

表1 四川廣元市血小板固定獻(xiàn)血員HPA-9基因分型

2.3 基因檢測電泳結(jié)果圖1中是4名四川廣元地區(qū)固定血小板獻(xiàn)血者的HPA-9基因檢測結(jié)果,如圖1所示。第一泳道為Marker,第二泳道和第三泳道是同一檢測樣本的HPA-9a、HPA-9b的基因檢測結(jié)果,依此類推是第二個、第三個和第四個樣本HPA-9基因檢測結(jié)果。128名四川廣元地區(qū)漢族基因分型結(jié)果均為HPA-9aa。

表2 四川廣元漢族與不同國家地區(qū)HPA-9基因頻率的比較

圖1 4名四川廣元地區(qū)固定血小板獻(xiàn)血者的HPA-9基因檢測結(jié)果

3 討論

由于血小板特異性抗原的復(fù)雜性,所以很難獲得特異性較高的單克隆抗體。HPA遺傳多態(tài)性的分子背景已經(jīng)十分清楚,是由于單核苷酸突變造成的,這為建立相應(yīng)的基因檢測方法成為可能。本研究通過PCR-SSP技術(shù)對128名血小板獻(xiàn)血者進(jìn)行基因分型,填補(bǔ)了四川廣元地區(qū)人群HPA-9人類學(xué)資料,同時也為該地區(qū)血小板庫的建立了增加一項(xiàng)重要指標(biāo)。由于血小板上HPA的不同,在血小板輸血、妊娠或骨髓移植等刺激下可以產(chǎn)生血小板抗體。在多次輸血的患者中,約有8%的可能性產(chǎn)生血小板特異性抗體[8]。血小板抗體可造成血小板輸注無效癥、新生兒溶血病以及器官移植排斥反應(yīng)等。國外曾報道過HPA-9bw的低頻抗體[9],提示HPA-9的基因檢測的重要性。當(dāng)前我國對HPA-9抗原進(jìn)行調(diào)查的較少。我國又是一個地域遼闊、人口眾多的多民族國家,因此十分必要對HPA-9進(jìn)行大規(guī)模的調(diào)查。本調(diào)查中沒有發(fā)現(xiàn)HPA-9bw,在高加索人、臺灣、上海漢族、濰坊漢族及邯鄲漢族也未見HPA-9bw的報道,四川廣元地區(qū)的HPA-9基因調(diào)查數(shù)據(jù)與上述地區(qū)沒有顯著差異。可能與調(diào)查人群數(shù)量均不大相關(guān),此項(xiàng)目仍需進(jìn)一步擴(kuò)大人群數(shù)量進(jìn)行調(diào)查。

[1]李執(zhí)如,王乃紅,楊群身,et al.HPA抗原基因頻率和不配合率[J].中國輸血雜志,2006,19(3）:236.

[2]趙桐茂.人類血型遺傳學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1987.218-226.

[3]Jones DC,Bunce M,Fuggle SV,et al.Human platelet alloantigns(HPAs）:PCR-SSO genotyping of a UK population for 15 HPA alleles[J].Eur J Immunogene,2003,30:415.

[4]Shih MC,Liu TC,Lin IL,et al.Gene frequencies of the HPA-1to HPA-13,Oe and Gov platelet antigen alleles in Taiwanese,Indonesian,Filipino and Thai populations[J].Int J MolMed,2003,12:609.

[5]Feng M L,Liu DZ,Shen W,et al.Establishment of an HPA-1to16-typed platelet donor registry inChina[J].TransfusionMedicine,2006,16:369.

[6]楊春晴,姜美林,等.濰坊地區(qū)漢族獻(xiàn)血者血小板特異性抗原HPA1-16系統(tǒng)基因多態(tài)性研究[J].中國輸血雜志,2008,21(1）:31.

[7]孫國棟,段現(xiàn)民,張彥平,等.獻(xiàn)血者血小板-16抗原基因遺傳多態(tài)性分析[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2005,13(5）:889.

[8]Boehlen F,Bulla O,Michel M,et al.HPA-genotyping and antiplatelet antibodies in female blood donors[J].Hematol J,2003,4(6）:441.

[9]Cecile Kaplan,Leendert Procelijn,Philippe V anlie feringhen,et al.Anti-HPA-9bw(Maxa）fetomatemal albinmunization,a clinically severe neonatal thrombocytopenia difficulties in diagnosis and therapy and report on eight family[J].Transfusion,2005,45(11）:1799.