596例壯族人群β-地中海貧血基因突變類型分析

覃志堅,龍顯科,王俊利,何印蕾,常正義

(右江民族醫學院,廣西 百色市 533000）

地中海貧血是一種常見的遺傳性血液病之一,其特點是因珠蛋白基因突變使血紅蛋白中珠蛋白鏈合成障礙,導致血紅蛋白成分組成結構發生改變,臨床上以慢性進行性溶血性貧血為主要表現。大部分患兒因輸血并發癥或嚴重貧血死于成年之前,目前全世界已發現了200余種β珠蛋白基因突變類型,中國人中發現了30種[1]。百色是β-地中海貧血病的高發地區,孕婦檢出率達6.74%[2],其基因類型及頻率分布具有明顯的地域及民族差異,本文對百色地區右江流域世居壯族進行了β-地中海貧血的研究,從596例壯族地貧基因攜帶者中進行β珠蛋白基因類型及頻率分布分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象

為右江醫學院附屬醫院檢驗科2005年至2010年間當地壯族就診者,經抗堿血紅蛋白(HbF）和血紅蛋白A(HbA）定量測定篩查檢出596名地貧基因攜帶者.男275名,女321名.年齡1d-75歲。祖籍及民族通婚情況均為純正壯族樣本。

1.2 實驗材料

1.2.1 儀器 實時熒光PCR分析系統由匹基生物公司提供;β-地中海貧血芯片檢測閱讀系統亞能生物有限公司提供。

1.2.2 試劑 PCR試劑盒及反向點雜交(RDB）β-地中海貧血的基因診斷試劑盒由亞能生物有限公司提供。按操作說明書進行。

1.3 實驗方法

1.3.1 血液標本的采集和保存 抽取靜脈血5 ml,EDTA-Na2抗凝,分離血漿與血細胞,-85℃存放。

1.3.2 β地中海貧血初篩 用醋纖薄膜對血紅蛋白液進行電泳分離、721分光光度計比色測定HbA2含量,用抗堿法測定HbF含量。[3]

1.3.3 外周血DNA提取 篩查出的陽性標本按常規的酚—氯仿抽提法提取DNA。

1.3.4 β珠蛋白基因突變分析[4]PCR擴增β珠蛋白基因:引物的5末端用生物素標記.與酶標抗生物素蛋白相結合作為檢測信號。長片段引物:Long fragment primer 600 bp擴增片段Amplified fragment,C1:5′-GTA CGG CTG TCA TCA CTT AGA CCT CA-3′,C2:5′-TGC AGC TTG TCA CAG TGC AGC TCA CT-3′,短片段引物:Interest paragraph primer 200 bp擴增片段 Amplified fragment,D5:5′-CAA TGT ATC ATG CCT CTT TGC A-3′,D6:5′-GAA TAA TCC AGC CTT ATC CCA A-3′

(1）基因組DNA提取:檸檬酸鈉抗凝全血2 ml,分離血漿與血細胞,-85℃存放,外周血DNA提取篩查出的陽性標本采用常規酚—氯仿抽提法抽提基因組DNA。(2）基因組DNAPCR:分別加入45 μ l PCR反應混合物至含有擴增所需的DNA多聚酶各管中;吸取2 μ l處理樣本上清液至PCR反應管中,混勻,5 000 r/min離心30 s。按下列參數進行PCR反應:94℃5 min(94℃60 s,55℃30 s,72℃60 s）×35個循環,72℃5 min。(3）雜交[5,6].取15 ml塑料離心管,編號,放入同樣標有編號的膜條,加入A液(2×SSC,0.1%SDS,pH 7.4）12ml,加入1支PCR產物,擰上離心管蓋。沸水中加熱10 min,取出,放入42℃雜交箱或水浴箱雜交(雜交時間應長于2 h）,同時取1只50 ml塑料管,加入40 ml B液(0.5×SSC,0.1%SDS,pH 7.4）,擰緊蓋子,一并置于42℃雜交箱或水浴箱中進行預熱(至少0.5 h）。(4）洗膜取出膜條,移至裝有預熱B液的50 ml管中,于42℃輕搖洗滌30 min(每管40 ml溶液）。(5）顯色:用鑷子小心取出膜條,用A液在平皿中室溫輕搖洗膜2次,每次5 min,再用C液(檸檬酸鈉14.7 g溶于450 ml純凈水,用鹽酸調pH值至5.0,最后定容至500 ml）室溫輕搖洗膜2次,每次2 min,將膜條浸泡于顯色液中避光顯色約10 min,將顯色的膜條在純水中快速漂洗1次,進行結果判定。(6）雜交結果判定:正常的PCR擴增產物只與正常寡核苷酸探針雜交,只在正常探針位置出現熒光信號,突變的雜合子則與正常和相應的突變探針雜交,在正常探針及突變探針位置均出現熒光信號,突變的純合子或雙重雜合子只與相應的突變探針雜交,在相應的突變探針位置出現熒光信號。

檢測中國人7個常見β-地中海貧血基因突變位點:CD41-42(-TCTT）,IVS-Ⅱ-654(C→T）,CD17(A→T）,-28(A →G）,CD71-72(+A）,CD17/-29。(6）結果判斷觀察膜條上出現的藍色斑點,在野生型探針相應的位點出現藍色斑點即為該位點的基因突變[7]。

2 結果

596例β-地貧攜帶者中,常見的基因突變位點為CD17 49.33%(294/596,其中純合子14例,雜合子206例,雙雜74例）;CD41-42 34.06%(203/596,其中純合子11例,雜合子130例,雙雜62例）;IVS-Ⅱ-654 8.39%(50/596,其中純合子1例,雜合子29例 ,雙雜 20例）;βE 8.05%(48/596,其中 βE雜合子32例 ,雙雜16 例）;CD71-72 4.36%(26/596,其中雜合子19例,雙雜7例）;-28 4.36%(26/596,其中雜合子16例,雙雜10例）;CD17/CD-29 0.17%(1/596）。頻率最高為CD17,其次為CD41-42,結果見表1。

表1 β-地中海貧血基因突變純合子、雜合子分布頻率[例(%）]

3 討論

地中海貧血是一種遺傳病,目前尚無良好的根治辦法,當患者嚴重貧血時,只能依賴長期輸血和合理的除鐵方法維持生命,給家庭和社會造成極大的負擔。百色市地處廣西西部,人口378.8萬人(2006年統計）,壯族約占總人口的80%,瑤族、苗族、回族、彝族、仡佬族約占 6%。百色地區β-地中海貧血突變頻率與廣西省已有的研究資料接近,從地理分布上看廣西不同地區的β-地中海貧血基因型及其發病率多有差異.百色地區以CDl7最常見,其余地區則是CD4l-42最多見[8].吳惠珍等對百色市孕婦地中海貧血的篩查結果顯示,α-和β-地貧的總攜帶率為18.15%,其中α-地中海貧血雜合子為 11.41%,β-地中海貧血為6.74%。與報道的廣西南寧地區及柳州市隨機人群篩查的結果近似,比廣東省高[2]

本研究運用基因芯片技術,完成了596例壯族人群β-地貧基因攜帶者的珠蛋白基因突變分析,共檢測到7種常見突變類型。頻率最高為CD17,其次為CD41-42,有別于作者前一研究論文結果(CD41-42 46.20%、CD17 29.35%）[3],因前一篇論文研究對象為整個區域,不分民族,本文主要對象為壯族人群,與王報道的相符[8]。吳曉黎等[9]對貴州省苗族、水族、瑤族中的基因突變型特點、基因型頻率及分布規律研究中發現,受檢2566人群中,共檢出134例β-地中海貧血攜帶者,總檢出率為51.22%,其中苗族、水族、瑤族檢出率分別為41.72%,61.06%,41.45%。經β珠蛋白突變基因分析,在這3個民族中僅檢出兩種中國人常見突變型CD41-42和CD17,檢出率分別為88.11%,60.10%,23%。單可人等研究結果也顯示侗族人群中只檢出CD17(77%）、CD41-42(23%）兩種基因突變類型,而在土家族人群中檢出 CD17(23.1%）、CD41-42(69.2%）、卻有別于貴陽地區和前人報道的貴州β-地中海貧血基因突變類型情況[10],李毅等在瑤族同胞β-地中海貧血受檢的26例攜帶者中,經PCR-RDB檢出CD41-42突變1例、CD17突變6例,結論為荔波瑤族人群中β珠蛋白基因變異情況很單一,很有自己獨特的特點[11]。提示基因突變類型具有顯著的民族特征。

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