磷脂酰肌醇蛋白多糖-3在肝細胞肝癌的表達及其與術后復發的相關性

蔣國華,廖維甲,覃理靈,梅銘惠,陳 謙,袁晟光,劉 杰

(1.桂林市衛生學校,廣西桂林 541002;2.桂林醫學院附屬醫院,廣西桂林 541001）

AFP診斷HCC是目前公認的腫瘤標志物,但陽性率僅為70%左右,假陰性率達30%,且AFP水平高低與腫瘤大小有關,不利于HCC的早期診斷和小肝癌的發現,尤其是術后復發的預測。HCC根治切除術后3年和5年的復發率分別高達50%和70%[1],需要尋找更加敏感的早期診斷和術后復發監測指標。近年發現磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC-3）與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關,它是一種細胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白,基因位于人染色體X26.10,由8個外顯子組成,啟動子區有多個轉錄因子結合位點[2],國內學者對GPC3研究不多,國外學者對GPC-3在HCC的發生和發展提出了一些假說。本文采用RT-PCR方法對HCC癌組織及癌旁組織測定GPC-3 mRNA的表達水平。

1 材料與方法

1.1 標本60例HCC癌組織及其癌旁組織取自本院肝膽外科HCC手術切除的肝臟組織。男52例,女性8例,平均年齡49歲;腫瘤直徑＜5 cm 13例,5 cm＜腫瘤直徑＜10 cm 28例,＞10 cm或伴有肝內外轉移19例;腫瘤數目單個47例,2個或2個以上13例;腫瘤有完整包膜24例,無包膜或包膜不完整36例;11例有鏡下門靜脈癌栓,血清AFP陽性41例,HBsAg陽性56例。所有的組織標本均經術后病理檢查證實。60例癌旁組織病理診斷:18例慢性肝炎,36例肝硬化,6例正常組織。標本經手術切除后立即分裝放入液氮保存。

1.2 試劑和儀器RNA提取試劑盒Trizol(Invitrogn公司）,maker、RT-PCR試劑盒(寶生物工程(大連）有限公司）,紫外分光光度計和RT-PCR儀(BIO公司）。

1.3 引物設計與合成根據GenBank的相應cDNA序列,運用Premier 5.0軟件設計GPC-3和β-Actin引物序列,并經Pubmed Blast對比分析,均具有較好的特異性,由上海生物工程公司合成。設計GPC-3上游引物序列為:5′-CCAACATGCTGCTCAAGAAAGATGGAAG-3′,下游引物序列為 :5′-CAAACTCAAAAGCTTGTGGAGTCAGGCT-3′,擴增片段長度為 226 bp;內對照基因β-Actin的上游引物序列為:5′-TCAC2CCACA CTGTGCCCATCTACGA-3′,下 游 引 物 序 列 為 :5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′,擴增片斷 長度為400 bp。

1.4 方法取HCC組織、癌旁組織約50 mg制成勻漿,加入1 ml TRIzol,冰浴。吸1 ml勻漿液至離心管中,4℃離心 12 000 r/min×10 min。取上清0.8 ml,加入0.2 ml氯仿,震蕩2 min,4℃離心10 000 r/min×10 min,取上清0.3 ml,加100%異丙醇0.3 ml,再加50%異丙醇0.5 ml,震蕩30 s,4℃離心12 000 r/min×5 min,棄上清,加1 ml 750 ml/L乙醇,輕輕洗滌沉淀,4℃離心12 000 r/min×5 min,棄上清,室溫靜置3 min,將乙醇晾干,加20 μ l 0.1%氯化鋰溶解沉淀。抽提的 RNA質量鑒定:紫外分光光度計定260/280比值(比值均在1.7-2.0）;并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解,所用RNA均無降解。為了去除基因組DNA的污染,全部RNA均用無RNA酶的DNA酶Ⅰ消化后,置-80℃備用。

總RNA通過逆轉錄反應合成cDNA,進行PCR擴增,PCR反應條件均為94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退 30 s,72℃延伸 40 s,共 35循環(βactin為28循環）。PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳,經灰度掃描,凝膠圖像分析儀分析,以GPC-3和βactin的比值作為GPC-3 mRNA的相對含量。對病人的臨床病理學資料進行分析,研究HCC病人的GPC-3 mRNA陽性和陰性表達與其性別、年齡、腫瘤的大小 、腫瘤數目 、AFP 、HBsAg、有無包膜 、轉移 、門靜脈癌栓各指標間的關系;探討GPC-3 mRNA表達水平與HCC術后復發的關聯性,在筆者課題組的一項研究中,曾將肝癌術后3年內不復發患者設定為預后良好組,反之亦然[3]。

1.5 統計學處理應用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗和卡方檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GPC-3 mRNA在HCC組織及癌旁組織中的表達RT-PCR檢測結果表明,60例HCC標本中,HCC癌組織中GPC-3 mRNA表達陽性的有41例,陽性率68.3%,癌旁組織中GPC-3 mRNA低表達或不表達。其中24對HCC的PCR產物電泳圖如下圖1。PCR產物在瓊脂糖凝膠上的電泳圖,經灰度掃描,系統軟件分析,HCC組織、癌旁組織的GPC-3與β-actin比值的相對含量分別為:0.53±0.13,0.23±0.05,其差異有顯著性,見表1。

圖1 基因GPC-3在HCC癌組織高表達(RT-PCR）

表1 基因GPC-3在HCC癌組織及癌旁組織表達水平的比較

2.2 統計學分析GPC-3mRNA陽性和陰性表達與其腫瘤大小、腫瘤數目、有無包膜、門靜脈癌栓、HB-sAg及AFP水平各指標間均無明顯差異(P＞0.05）;而與HCC術后3年內是不是復發有直接關系,在60例HCC標本中,有18例3年內不復發,其中GPC-3 mRNA表達陰性為15/18(83.3%）,表達陽性為3/18(16.7%）,兩者比較有統計學意義(P＜0.05）。

3 討論

目前國內學者對GPC-3研究甚少,國外研究表明,GPC-3在肝癌組織中mRNA呈高表達[4],而在成人正常組織、HCC癌旁組織、肝炎、肝硬化組織中表達量極低或不表達[5,6];本研究證實這一點,實驗結果表明,GPC-3 mRNA在HCC癌組織中高表達,陽性率68.3%,而在癌旁組織中為低表達或不表達,GPC-3在HCC組織中有穩定的表達,提示其在HCC的發生發展中具有重要作用,這種選擇性表達特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點。也可能是一種新的HCC的癌胚抗原。因此,近年來倍受關注,被學者稱之為HCC新的特異性標志物及潛在分子治療的靶點[7,8],GPC-3能顯著提高小肝癌與肝硬化結節的鑒別診斷[8]。

本研究發現GPC-3 mRNA的表達與其腫瘤大小、腫瘤數目、有無包膜、門靜脈癌栓、HBsAg及AFP水平各指標間均無明顯差異(P＞0.05）,提示檢測HCC組織中的GPC-3基因的表達對于預測腫瘤的惡性程度、病情輕重無明顯價值。尤其是GPC-3 mRNA的表達高低與血清AFP水平無明顯差異,在血清AFP陰性的原發性肝癌中仍有一定的陽性率,提示對血清AFP陰性的肝癌診斷具有一定的輔助意義,有望作為比AFP更加理想的肝細胞癌早期診斷的敏感標記物。但也有學者指出:GPC3是一個細胞周期相關的蛋白質[9],其在肝癌的發生、發展、信號通路等方面的研究也得到了廣泛關注。

目前外科切除仍然是HCC最主要和有效的治療方法,但絕大多數HCC患者發現時較晚,不一定有手術機會;另外,根治性切除術后的高復發率已成為提高肝癌生存率的一個瓶頸,也是攻克肝癌最重要的難關之一。因此,早期預測、診斷肝癌的復發,并采取有效措施進行干預是進一步提高肝癌外科療效的關鍵。GPC-3 mRNA表達與HCC術后3年內是不是復發有直接關系,術后3年內不復發HCC患者的癌組織中GPC-3 mRNA呈現低表達水平,而在術后3年內復發HCC患者癌組織中呈現高表達水平。本研究雖然采用的病例數有限,但它卻提示了:GPC-3 mRNA高表達水平極大地增加了HCC患者術年復發風險,也說明GPC-3可能是判斷HCC預后重要指標;同時可以設想,通過外界因素,如小分子的GPC-3靶向藥物、siRNA干擾等人工沉默敲除GPC-3基因,以達到降低HCC患者肝癌組織中GPC-3表達水平的目的,從而減少HCC患者術后復發的風險。迄今為止,人們對GPC-3的了解,尤其是在HCC中的了解十分有限,它的諸多功能、作用機制以及與相關基因的相互關系等許多方面還不十分清楚,有待于進一步深入研究。

[1]Llovet JM,Bu rroughs A,Bru ix J.Hepatocellular carcinoma[J].Lancet,2003,362(9399）:1907.

[2]Baumhoer D,Tornillo L,Stadlmann S,et al.Glypican 3 expression in human nonneoplastic,preneoplastic,and neoplastic tissues:a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples[J].Am J Clin Pathol,2008,129:899.

[3]Xie XW,Mei MH,Liao WJ,et al.Expression of CIITA-related MHCII molecules in tumors linked to prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Int J Oncol.2009Mar;34(3）:681.

[4]Lai JP,Oseini AM,Moser CD,et al.The oncogenic effect of sulfatase 2 in human hepatocellular carcinoma is mediated in part by glypican 3-dependent Wnt activation[J].Hepatology,2010,52(5）:1680.

[5]Yam auchi N,Watanabe A,H ishinuma M,et al.The glypican 3 oncofetal protein is a promising diagnostic markerfor hepatocellular carcinoma[J].Mod Pathol,2005,18(12）:1591.

[6]Saito Y,Oba N,Nishinakagawa S,et al.Identification of beta2-microgloblin as a candidate for early diagnosis of imaging-invisible hepatocellular carcinoma in patient with liver cirrhosis[J].Oncol Rep,2010,23(5）:1325.

[7]Suzuki M,Sugimoto K,Tanaka J,et al.Up-regulation of glypican-3 in human hepatocellular carcinoma[J].Anticancer Res,2010,30(12）:5055.

[8]DiTommaso L,Franchi G,Park YN,et al.Diagnostic value of HSP70,glypican 3,and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis[J].Hepatology,2007,45(3）:725.

[9]Liu B,Bell AW,Paranjpe S,et al.Suppression of liver regeneration and hepatocyte proliferation in hepatocyte-targeted glypican 3 transgenic mice[J].Hepatology,2010,52(3）:1060.