NGF預處理對AMI大鼠心肌VEGF及其受體KDR/flk-1表達的影響

李 穎,孫 新,郭華濤,熊 英,翟羽佳,徐 雷

(北華大學1.附屬醫院心內科,2.生命科學中心,吉林 吉林市 132011）

近年來研究發現神經生長因子(NGF）家族及其受體在心血管系統中存在廣泛表達,并參與多種心臟疾病的病理生理過程。我們前期的研究表明[1],外源性給予NGF可有效地保護大鼠心臟交感神經支配,可維持一定數量的神經元存活,使心肌損傷壞死面積減少。NGF還可促進心臟缺血組織的血管形成。我們擬研究NGF預處理對大鼠心肌VEGF及其受體KDR/flk-1表達的影響,探討NGF對心肌損傷修復的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立雄性成年Wistar大鼠60只,隨機分為3組:NGF預處理組和非NGF預處理組和對照組(每組20只）。大鼠NGF預處理使用注射用鼠神經生長因子(0.5 μ g/kg）尾靜脈注射。采用結扎左冠狀動脈前降支制作大鼠急性心肌梗死動物模型。于手術后7天取材。乙醚麻醉下處死動物,大鼠股動脈采血,取大鼠心肌組織,分別做常規石蠟包埋和即刻液氮冷藏。

1.2 試劑注射用鼠神經生長因子購自武漢海特生物制藥股份有限公司;Trizol為美國Invitrogen公司產品;RNA PCRKit(AMV）Ver.3.0試劑盒購自寶生物工程(大連）有限公司;血管內皮生長因子(VEGF）及其受體KDR/flk-1 PCR引物由上海英俊生物科技有限公司合成。VEGF引物(495 bp）,上游:5′-tggctttactgctgtacctcc-3′,下游 :5′-acaaatgctttctccgctct-3′;KDR/flk-1 引物(418 bp）,上游 :5′-tcacggttgggctactgc-3′,下游:5′-agaccttctgccatcacg-3′;內參 GAPDH 引物 (139 bp）,上游:5′-tatcggacgcctggttac-3′,下游:5′-ctgtgccgttgaacttgc-3′。

1.3 方法

1.3.1 心肌組織病理切片觀察:取心肌標本制作石蠟切片,HE染色后觀察形態學改變。心肌損傷程度用專用顯微鏡測量及Motic Imaging Previmer醫學圖像分析系統進行結果分析。選擇單點彩色分割(放大倍數為66倍）測定心肌壞死灶面積占心肌總面積的百分數(面密度,%）。

1.3.2 RT-PCR法檢測大鼠心肌組織中VEGF、KDR/flk-1 mRNA表達:Trizol一步法提取凍存心肌總RNA,按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV）Ver.3.0試劑盒說明操作,合成并擴增cDNA。擴增反應條件:預變性94℃,4 min;變性 94℃,30 s,退火 54℃(VEGF、KDR/flk-1）、55℃(GAPDH）,30 s,延伸 72℃,45 s,30個循環;終末延伸72℃,7 min。以Fermentas公司的Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder為Marker。用Kodak Digital Science 1D系統進行圖像掃描分析,測定大鼠心肌組織中VEGF、KDR/flk-1 mRNA表達水平。

1.4 統計學處理實驗結果為計量資料,數據以ˉx±s表示,用SPSS 14.0軟件進行統計分析。正態分布數據采用方差分析(One-Way ANOVA）,兩組間比較采用t檢驗、多組間兩兩比較采用q檢驗。兩變量之間的關系應用一元線性相關分析。α=0.05作為差異具有統計學顯著意義的標準。

2 結果

2.1 大鼠心肌組織的病理變化正常對照組大鼠心肌組織病理切片觀察未見異常。非NGF預處理組大鼠心肌組織損傷、壞死的部位主要在左心室游離壁、心內膜下心肌和心尖部等處。可見大片狀壞死和多發灶狀壞死,壞死中心心肌細胞崩解消失,并有大量炎細胞浸潤。NGF預處理組大鼠心肌損傷程度輕,壞死面積小,多呈小灶狀和條狀,局部有少量炎細胞浸潤,二者比較差異具有統計學顯著意義(P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠心肌壞死面積病理檢測結果比較(±s）

表1 大鼠心肌壞死面積病理檢測結果比較(±s）

注:*與非NGF組比較,P＜0.01;

組別 n 心肌壞死面積(%）NGF組 20 25.41±9.06*非NGF組 20 40.08±11.38

2.2 大鼠心肌組織中VEGF和KDR/flk-1的mR-NA表達大鼠心肌VEGF mRNA擴增產物電泳可見3個條帶(260-500 bp）,對應VEGF的三個亞型VEGF120、VEGF164 和 VEGF188。VEGF mRNA 和KDR/flk-1的mRNA(407 bp）的表達在對照組的表達水平很低,心梗后升高,NGF預處理組也高于非NGF預處理組(P＜0.01）;各實驗組大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1mRNA表達光密度比值的統計結果見表2。

表2 各組大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1 mRNA表達結果比較(±s,%）

表2 各組大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1 mRNA表達結果比較(±s,%）

注:*與非NGF組比較,P＜0.01.

組別 n VEGF/GAPDH KDR/flk-1/GAPDH對照組 20 4.06±3.07 5.18±4.76 NGF組 20 45.41±11.54* 47.40±7.83*非NGF組 20 32.34±8.10 31.08±7.88

2.3 相關分析大鼠心肌VEGF mRNA表達與KDR/flk-1mRNA表達之間呈正相關關系(r=0.691,P＜0.01）。說明大鼠心肌中VEGF mRNA表達與KDR/flk-1mRNA表達同步上調。

3 討論

我們的結果表明,NGF預處理組大鼠心肌損傷程度輕,壞死面積小。對照組大鼠心肌中VEGF及其受體KDR/flk-1的表達水平都很低,心梗后其表達水平上調,NGF預處理組更是明顯高于非NGF預處理組。NGF預處理可能通過上調VEGF水平促進血管新生,減輕大鼠心肌損傷,從而產生保護作用。Calza等[2]通過對新生大鼠頸上神經節(SCG）的研究發現,NGF不僅可促進SCG內神經元的發育,而且SCG內的血管內皮細胞肥大、增生,血管床面積增大,進一步研究發現SCG內的VEGF表達也增多。在外周神經,NGF也同樣可通過促進VEGF的表達,間接地促進血管形成[3]。Turrini等[4]將狗的股動脈阻斷后,后肢的內收肌和腓腸肌缺血,結果NGF及其受體表達上調,缺血肢體微動脈的形成較對照組增加90%以上。可見這種內源性的NGF釋放增加不僅與神經保護和神經修復作用相關,還可促進缺血組織血管形成。體內、外實驗均證實NGF可促進局部缺血組織的血管形成[5,6,7]。我們的結果與此一致,也是在微血管及其周圍表達豐富。進一步研究發現,心肌缺血時VEGF表達增加可促進側支循環的建立[8]。編碼VEGF-165的裸露質粒DNA,注射到急性心肌梗死病人的缺血心肌部位,結果發現癥狀減輕,心肌血管管徑增加[9]。VEGF還有可能促進心肌細胞的再生[10]。有研究發現,KDR/flk-1和具有活力的心肌組織相關,心梗急性期KDR/flk-1表達下降[11]。本研究中正常對照組的KDR/flk-1的表達很低,而心梗后其表達升高,并沒有表現出急性損傷時的下降,可能是因為我們的研究中并沒有將壞死區域與正常心肌進行比較,而是對整個心臟的綜合指數進行分析;我們的結果顯示,VEGF和KDR/flk-1mRNA表達呈正相關,VEGF與其受體平行上調可增加心肌新生血管密度從而產生心肌保護作用。

由于嚙齒類動物與高級大型動物之間的差異,以及NGF劑量和干預時間的不同,NGF在心血管病臨床應用方面還需進一步深入研究。

[1]李 穎,王 銅,周令望,等.神經生長因子對大鼠心肌損傷后交感神經去支配及巢蛋白表達的影響.中國地方病學雜志,2007,26(2）:152.

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