CFTR及SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達及其意義

張 敏,王銀萍,倪勁松,薛世泉,鄒亞彬,張麗紅

(1.吉林大學白求恩醫學院病理生物學教育部重點實驗室,吉林長春 130021;2.吉林大學第一臨床醫院 病理科,吉林 長春 130021）

慢性胰腺炎是一種以胰腺進行性炎癥和纖維化為特征,最終引起胰腺結構和功能永久性破壞的疾病,慢性胰腺炎明確診斷20年后往往發展成為胰腺癌。慢性胰腺炎及胰腺癌病因復雜,遺傳基因異常在二者發病中的作用成為國內外研究的熱點,但目前尚無一致性定論。囊性纖維跨膜轉運調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR）及絲氨酸蛋白酶抑制劑 Kazal 1型(Serine protease inhibitor Kazal type 1,SPINK1）,是新近發現的與慢性胰腺炎及胰腺癌相關的兩種基因蛋白。CFTR是一種氯離子通道蛋白,調節Na--Cl-交換。SPINK1是一種胰蛋白酶抑制劑。國外研究者已發現CFTR及SPINK1基因突變及多態性與慢性胰腺炎密切相關。本研究通過免疫組織化學染色方法檢測了CFTR及SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達,為慢性胰腺炎及胰腺癌的防治從基因水平上開辟新途徑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本

慢性胰腺炎石蠟標本20例,男性12例,女性8例。患者年齡從 37-75歲,平均年齡為(43.3±11.6）歲。胰腺導管腺癌石蠟標本30例,男性20例,女性10例。患者年齡范圍50-75歲,平均年齡為(56±5.6）歲。正常胰腺組織標本10例,均為臨床進行Whipple手術切除所帶的胰腺組織,其中男性7例,女性3例,年齡56-73歲,平均年齡(65±5.3）歲。所有標本均經病理醫師復查,診斷無誤。

1.1.2 試劑

CFTR及SPINK1單克隆抗體(兔抗人）購于北京吉奧眾藝生物有限公司,SP免疫組化試劑盒和DAB顯色液購于福州邁新生物技術有限公司,FITC標記的熒光二抗購于長春鼎國生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色方法

采用SP染色法免疫組化,實驗步驟按SP試劑盒說明書進行,以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結果判定

CFTR以胰腺導管上皮細胞膜和細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達,每例隨機選取5個400倍視野觀察。采用染色強度和陽性細胞百分比雙重判定進行評分,并將二者評分乘積作為最終評分進行統計學分析。具體評分標準如下:染色強度判定:基本不著色為0分,著色弱為1分,中度著色為2分,著色強為3分;陽性細胞比例的判定:著色細胞占總細胞數的百分比＜10%為0分,10%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分,＞75%為4分。最后以陽性細胞的百分比得分和染色強度得分乘積做為最終結果進行判定。0分為陰性(-）,1-4分為弱陽性(+）,5-8分為陽性(++）,9-12分為強陽性(+++）,本文中所統計陽性率以+-+++作為陽性計算。

2 結果

2.1 CFTR蛋白的表達

正常胰腺對照組中幾乎所有的胰腺導管上皮細胞均可見陽性表達,陽性反應主要定位于細胞質中,少數定位于胞膜,為棕黃色細顆粒狀(圖1）,陽性率為100%。部分慢性胰腺炎中胰腺導管上皮細胞可見表達,陽性反應主要定位于細胞質(圖2）。陽性表達率為50%。胰腺導管癌細胞中偶見表達(圖3,圖4）,陽性表達率為10%。結果顯示,慢性胰腺炎及胰腺癌組表達結果均低于正常對照組,經 χ2檢驗,P＜0.05,組間差異顯著;胰腺導管癌組明顯低于慢性胰腺炎組(P＜0.05）(見表1）。

圖1 CFTR在正常胰腺組織中呈陽性表達400×

表1 CFTR在正常胰腺組織、慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達

2.2 SPINK1蛋白的表達

正常胰腺對照組中在幾乎所有的胰腺腺泡細胞及胰管上皮內均可見陽性表達,SPINK1的陽性反應主要定位于細胞質中(圖5）,陽性率為100%。慢性胰腺炎組織中腺泡細胞及胰腺導管細胞的胞質可見表達(圖6）,陽性率為55%。胰腺癌細胞中偶見表達,主要定位于細胞核(圖7,8）,陽性率為6.7%。結果顯示,慢性胰腺炎及胰腺癌組表達結果均低于正常對照組,經 χ2檢驗,P＜0.05,組間差異顯著;胰腺導管癌組明顯低于慢性胰腺炎組(P＜0.05）詳見表2。

圖3 CFTR在高分化胰腺癌中呈弱表達400×

圖4 CFTR在低分化胰腺癌中呈弱表達400×

圖5 SPINK1在正常胰腺組織中呈強陽性表達400×

圖6 SPNK1在慢性胰腺炎中呈弱陽性表達400×

圖7 SPINK1在高分化導管癌中呈弱表達400×

圖8 SPINK1在低分化胰腺導管癌中呈弱表達400×

表2 SPINK1蛋白在正常胰腺,慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達

3 討論

CFTR是分布于胰腺、腸道及膽管等部位上皮細胞游離膜上的一種氯離子通道,它在跨上皮鹽類的轉運、水份流動和離子濃度調節中發揮重要作用[1-3]。異常CFTR可能導致經由上皮層的液體轉運發生改變[4],細胞無法進行正常分泌活動,導致水分流失和分泌物粘稠,從而引起局部組織的阻塞和感染。

SPINK1又稱胰分泌性胰蛋白酶抑制劑Kazal 1型,正常狀態下,SPINK1-胰蛋白酶復合物一起分泌入胰管,到達小腸后SPINK1分離或降解,胰蛋白酶抑制解除[5]。眾所周知,胰腺炎的發生與胰蛋白酶原的異常激活有關,所以SPINK1蛋白在胰腺炎發病過程中可能充當的是對抗激活的胰蛋白酶原的第一線保護機制[6]。

3.1 CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中的表達及其意義

本實驗結果顯示,CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中呈弱表達,明顯弱于正常的胰腺組織。可見CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中表達丟失,這種表達異常可能與二者的發生及發展存在著一定關系。由于CFTR功能不全,離子分泌障礙,導致分泌液PH值下降。酸性環境在引起組織炎癥損害的同時,還會導致胰酶分泌及激活的異常,最終導致胰腺的纖維化及功能不全[7]。Smith[8]認為較低離子濃度是機體保持消滅微生物能力的一個重要因素,而CFTR表達異常時氯化鈉濃度較高,機體清除病原體能力下降,這也是機體感染的一個重要原因。推測CFTR蛋白表達異常時,分泌的胰液濃縮而阻塞胰腺導管使其抗感染能力下降,最終導致慢性炎癥的發生。CFTR蛋白的缺失改變了胰腺細胞內的PH值,而PH值的變化又影響細胞的分化增殖及細胞周期[9]。

3.2 SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達及其意義

本實驗中SPINK1蛋白在慢性胰腺炎組中的表達顯著低于正常胰腺組,提示由于SPINK1蛋白表達的降低,失去了對胰蛋白酶的抑制作用而導致胰腺炎癥的發生,這與Witt等[10]研究的SPINK1基因突變與慢性胰腺炎相關性的結果相似。本研究結果顯示,SPINK1蛋白在胰腺癌中的表達顯著低于正常胰腺組及慢性胰腺炎組。表達部位及強度的改變,提示SPINK1蛋白的異常表達可能參與了慢性胰腺炎向胰腺癌的發展過程。推測在慢性胰腺炎向胰腺癌的發展過程中,SPINK1蛋白可能是作為一種致病因子或一種修飾因子,降低了胰腺癌發病的閾值或是與其他的基因蛋白一起促進了胰腺癌的發生,也可能由于細胞發生癌變導致SPINK1蛋白表達部位及強度的變化。

綜上所述,通過對CFTR和SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達情況分析,推測兩種蛋白表達的異常與慢性胰腺炎及胰腺癌的發生有一定關系,亦可能是作為一種附加因素與其他致病因素共同作用導致慢性胰腺炎及胰腺癌的發生。本次研究為胰腺疾病復雜病因的探索開拓了新思路,隨著研究的深入必將進一步明確胰腺疾病的病因,為胰腺炎及胰腺癌診斷、防治提供新的策略。

[1]Ignáth I,Hegyi P,Venglovecz V,et al.CFTR Expression But Not Cl-Transport is invoved in the Stimulatory Effect of Bile Acids on Apical Cl-/HCO3-Exchange Activity in Human Pancreatic Duct Cells.Pancreas.[N]2009 Sep 10.

[2]Myerburg MM,King Jr JD,Oyster NM,et al.AMPK Agonists Ameliorate Sodium and FluidTransport and inflammation inCF Air way Epithelial Cells[J].Exp Biol,2009,212(Pt 15）:2365.

[3]Mornon JP,Lehn P,Callebaut I.Molecular models of the open and closed states of the whole human CFTR protein Cell Mol Life Sci[N].2009 Aug 26.

[4]Keiles S.Kammesheidt A1 Identification of CFTR,PRSS1,and SPINK1 mutations in 381 patients with pancreatitis[J].Pancreas,2006,33(30）:221.

[5]王 偉,王 劍.SPINK1基因突變與特發性慢性胰腺炎研究進展[J].國際內科學雜志,2008,35(3）:261.

[6]Liddle RA.Pathophysiology of SPINKmutations in pancreatic development and disease[J].Endocrinol Metab Clin North Am,2006,35(2）:345.

[7]Choi JY,Lee MG,Ko S,et al.Cl-dependent HCO-3 transport by cystic fibrosis transmembrance conductor regulator[J].JOP.2001,2(4Suppl）:243.

[8]Smith JJ,Travis SM,Greenberg EP,et al.Cystic fibrosis air way epithelia fail to kill bacteria because of abnormal airway surface fluid[M].Cell,1996,85:229.

[9]Pappas CA,Ullrich N,Sontheimer H,et al.Redution of gilial proliferation by K+channel blockers is mediated by changes in Phi[R].Neuroreport,1994,6(1）:193.

[10]Witt H,LuckW,HenniesHC,et alMutations in the gene encoding the serine protease inhibitor,Kazal type 1 are associatedwith chronic pancreatitis[M].Nat Genet,2000,25(2）:213.