體外誘導人羊膜上皮細胞分化為神經樣細胞

劉紅敏,陳旭東,華新宇

(漯河醫學高等專科學校組織胚胎學教研室,河南漯河 462002）

近年來雖然胚胎干細胞、神經干細胞、骨髓基質細胞治療神經系統病變已取了成績,但胚胎干細胞和神經干細胞取材難,且有倫理方面和移植后易形成瘤的困擾,而骨髓基質細胞要跨胚層分化且取材時對機體損傷大,對神經系統疾病的臨床治療也不盡人意。近年來研究證明人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells,hAECs）具有部分胚胎干細胞特性[1-2],可分化為3個胚層不同類型的細胞[3-6],誘導劑和方法被認為是關鍵因素。本實驗比較了兩種化學誘導劑誘導人羊膜細胞向神經細胞方向分化的情況,以尋求一種較為理想的誘導劑及方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MEM培養基購自(美國Gibico公司）;人羊膜上皮細胞WISH細胞株購于中國科學院上海生命科學研究所;小鼠抗人NSE、GFAP單克隆抗體、兔抗鼠SP-Kit檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(棕黃色）均購于北京中杉金橋生物工程公司;胎牛血清(購自杭州四季青生物工程材料有限公司）;堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF）、全反式維甲酸(alltransretinoic acid,ATRA）、丁酸羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA）、胰酶購于sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預誘導液和誘導液的配制 以含10%胎牛血清和10 μ g/L堿性成纖維細胞生長因子的MEM培養基作為預誘導液;以含1 μ mol/L全反式維甲酸和無血清的的MEM培養基作為一種誘導液;以200 μ mol/L丁酸羥基茴香醚和無血清的MEM培養基作為另一種誘導液。

1.2.2 細胞的準備 人羊膜WISH細胞懸于10%胎牛血清的MEM 培養基,按2×104個/ml接種于25 ml培養瓶中,置37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養。24 h換液后,除去未貼壁的細胞和殘渣。倒置顯微鏡下觀察,待細胞生長至80%融合時用0.25%胰酶消化傳代準備誘導。

1.2.3 人羊膜上皮細胞誘導分化 預誘導hAECs按2×105個/ml密度接種于預先置6孔板中制備細胞爬片,每孔加含10%胎牛血清的MEM培養基培養,待細胞80%融合時,吸去孔中的培養液。將細胞分為3組,第一組為對照組,加入等量的含血清MEM培養基,第二組為全反式維甲酸誘導組加入預誘導液(10%胎牛血清+10 μ g/L堿性成纖維細胞生長因子+MEM培養基）,第三組為丁酸羥基茴香醚誘導組加入預誘導液(10%胎牛血清+10 μ g/L堿性成纖維細胞生長因子+1 mmol/L巰基乙醇+MEM培養基）,三組培養24 h。吸棄孔中液體后用D-Hank,s液洗兩次,ATRA誘導組加入含1 μ mol/L全反式維甲酸和無血清的的MEM培養基進行培養,BHA誘導組加入含200 μ mol/L丁酸羥基茴香醚和無血清的MEM培養基進行培養,對照組為等量的無血清MEM培養基進行培養,倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫細胞化學檢測 誘導12 h后的細胞用0.1 MPBS洗滌2次后,用4%多聚甲醛固定30 min,用0.1%TritonX-100作用10 min,0.1M PBS洗3次,余下步驟按免疫組織化學染色試劑盒說明操作(SP法）。一抗為1∶100小鼠抗人神經元烯醇化酶(NSE）單克隆抗體和1∶100小鼠抗人膠質纖維酸性蛋白(GFAP）單克隆抗體。DAB顯色,光鏡觀察,隨機取10個不同視野(×100）,計算神經元樣細胞占總細胞的比例,結果用(ˉx±s）表示。以PBS為一抗作陰性對照。

1.2.5 統計學處理 各組間比較用方差分析,兩兩比較用LSD法檢驗。采用SPSS15.0軟件包完成數據分析(P＜0.05）。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態

hAECs經預誘導液作用24 h后,無明顯形態變化。ATRA組加入誘導液ATRA后,2 h后開始發生形態變化,hAECs的胞體向內收縮,呈球形或錐形,并向周圍長出較長的突起,12 h后部分細胞出現雙極或多極的細胞突起,少數細胞突起末端還出現分支,轉變為類似神經元的形態,24 h后神經元樣細胞未見明顯增多,但少量細胞突起連接成網狀,誘導48 h后,神經元樣細胞逐漸萎縮;而BHA組加入誘導液后,細胞生長速度較ATRA組慢,細胞形態幾乎無發生改變,對照組細胞一直保持寬大的多邊形狀態,細胞無明顯增殖。3 d后見到不少漂浮的細胞。

2.2 誘導分化細胞免疫細胞化學顯色鑒定(圖1）

對照組細胞形態仍然呈寬大多邊形NSE陽性細胞,誘導12 h后,ATRA組NSE免疫組化顯示陽性細胞胞質著色染為棕黃色,胞核不著色,BHA組細胞NSE陽性細胞胞質著色染為棕黃色。誘導組和對照組GFAP染色基本無陽性細胞顯示。

2.3 統計學分析結果

每組隨機選取10個視野,統計分析陽性細胞率差異具有顯著性(表1）,其中以ATRA組陽性率最高,對照組陽性率最低。

3 討論

目前人羊膜上皮細胞向神經細胞方向分化誘導、調控方面的研究很少,人羊膜WISH細胞來源于正常足月妊娠的人羊膜上皮細胞,對研究人羊膜上皮細胞的生物學特性有重要作用[7]。也是體外研究羊膜上皮細胞的生物特性及其功能調節的有效實驗模型。

表1 三組NSE、GFAP陽性細胞百分比例值(±s）%

表1 三組NSE、GFAP陽性細胞百分比例值(±s）%

P＜0.05

組別 NSE GFAP對照組 (38.43±1.61） 0 ATRA組 (91.86±2.62） 0 BHA 組 (63.12±1.25） 0

蔡哲[8]等研究表明羊膜組織中存在神經干細胞特異性標記蛋白Nestin表達陽性細胞,而且其中存在已分化的神經元和膠質細胞。ATRA是一種強烈的神經分化誘導劑,目前應用全反式維甲酸誘導胚胎干細胞或骨髓基質細胞向神經元分化研究較多,在本研究當中,ATRA誘導人羊膜上皮細胞12小時后大部分hAECs可轉變為神經元樣細胞,并有雙極和多極突起的出現,誘導24 h后一些神經元之間可形成網狀,結合免疫細胞化學染色結果,誘導12 h時,ATRA誘導組大部分細胞呈NSE陽性,NSE是神經細胞的特異性標志物,與Strbing等用ATRA處理胚胎干細胞后幾乎全部細胞分化成神經細胞的結果一致,同一時段,出現形態變化的hAECs數量與NSE陽性細胞數量基本一樣,提示形態和表型在誘導過程中都發生了明顯的變化,提示hAECs在ATRA誘導下,不僅從形態上,而且在分子水平上皆有向神經元樣細胞分化的改變。BHA和巰基乙醇均為強的抗氧化劑,BHA的抗氧化作用更強,常用作神經細胞誘導劑[9],本研究中BHA組陽性率低于ATRA誘導組但高于對照組,且BHA組NSE陽性細胞形態并未發生明顯變化。三組中GFAP標志物均呈陰性,說明誘導分化出的細胞不是神經膠質細胞。但誘導后的細胞是否具有神經細胞的生理功能,成為真正意義上的神經細胞,能否合成分泌神經遞質,與其他細胞和組織建立突觸聯系,傳遞和接受神經沖動從而具有神經細胞的生理功能,還有待進一步深入研究。

血清會增加培養基的復雜性,抑制細胞分化[10],因此本實驗采用無血清的MEM培養基進行誘導,以更有效促進hAECs分化;3 d后倒置顯微鏡下見到部分細胞漂浮,可能與誘導液中缺乏血清營養有關。

從發育生物學角度來講,人羊膜上皮細胞源于外胚層成羊膜細胞,保持著早期外胚層細胞的多潛能特性,而神經元也來源于外胚層,分化無需跨胚層,此外,人羊膜上皮細胞源于大量被遺棄的胎盤,是再生醫學中沒有爭議的細胞來源,因此人羊膜上皮細胞可作為移植的前體細胞來源。hAECs向神經元樣細胞誘導分化將有望在神經系統損傷和退行性病變疾病的治療方面打開更廣闊的應用前景。

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