SIK2 shRNA重組腺病毒載體構建及其在3T3-L1脂肪細胞的表達

杜 靜,杜 玲,宴耀明,周 薇,陸 紅,鄒德學

(1.北京大學深圳醫院,廣東深圳 518036;2.襄樊市中醫院,湖北襄樊 441000）

隨著人們生活質量的提高,肥胖癥與高脂血癥的發病率日趨上升,已危害到人們的身體健康和生活質量,其防治成為當今亟待解決的問題。肥胖和高脂血癥的主要原因是能量代謝失衡。有研究表明SIK2是一種重要的脂肪組織特異性的能量調控蛋白,在脂肪細胞的能量代謝中發揮著重要的調節作用[1]。RNA干擾技術(RNA interfering,RNAi）是近年來迅速發展起來的生物技術,已成為基因功能研究以及基因治療的強有力工具[2]。實驗以短發夾(Short hair RNA,shRNA）腺病毒為介導,構建靶向干擾脂肪細胞SIK2基因的表達載體,為進一步研究SIK2的功能提供技術手段,對于了解SIK2在脂代謝中的作用和調控機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料3T3-L1細胞系購自ATCC公司。Lipofectamine 2000 脂質體和 Trizol、Adenoviral RNAi表達系統試劑盒購自Invitrogen公司。腺病毒純化試劑盒購自Cell Biolabs公司。二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG抗體、SIK2兔抗鼠抗體、化學發光試劑均購自Santa Cruz公司。胰蛋白酶購自Gibco公司。M-MLV逆轉錄酶(molony murine leukemia virus reverse transcriptase）購自 Promega公司,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF）膜購自Amersham公司,DMEM和胎牛血清購自Gibco公司。SIK2和三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）PCR引物由北京奧科生物技術有限公司合成,其余試劑均購自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒的設計 單鏈oligo、引物和探針設計:參照已發表的SIK2序列(NM-015191）設計互補ss oligos和引物,見表1。

表1 單鏈oligo引物設計

Oligo正義鏈中cgaa序列和反義鏈中ttcg序列為短發夾RNA的莖環結構,底劃線部分序列為和穿梭質粒連接時的接頭設計。以上序列由Invitrogen公司合成。

1.2.2 構建shRNA重組腺病毒 單鏈oligos經95℃變性5 min,與Invitrogen公司提供的線性化卡那霉素抗性pENTR/U6載體進行連接得到pENTR/U6-sh-RNA-SIK2穿梭質粒,轉TOP10感受態菌擴增。挑不同單克隆菌送Invitrogen公司測序鑒定。LipofectamineTM2000脂質體轉染pENTR/U6-shRNA-SIK2質粒進入3T3-L1細胞。Trizol提取總RNA,以三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）的表達作為內參(相應引物的序列見表1）。Real-time RT-PCR篩選最有效RNA干擾pENTR/U6-shRNA-SIK2質粒。篩選得到pENTR/U6-shRNASIK2穿梭質粒、pENTR/U6-shRNA空質粒和腺病毒骨架質粒pAd/BLOCK-iTTm-DEST進行同源重組,氨芐青霉素選擇培養基篩選陽性克隆。以空重組質粒作為對照,重組pAd-shRNA-SIK2質粒經Pacl酶切后,用LipofectamineTM2000脂質體轉染70%貼壁的HEK293A細胞。收集完全病變培養孔中的細胞及培養液,-20℃和37℃反復凍融3次,上清加入293A細胞中繼續感染擴增腺病毒。經多輪感染后獲得高滴度的Ad-shRNA-SIK2重組腺病毒和空載體病毒。

1.2.3 重組腺病毒純化、濃縮和滴度測定 按照試劑盒說明書操作,采用特殊的純化膜從腺病毒粗提取液中特異性吸附病毒顆粒進行純化和濃縮。病毒的滴度通過測定游離病毒顆粒的吸光度值進行確定(在260 nm處的1個吸光度值相當于1012病毒顆粒/ml）。提純后的重組腺病毒濃度可達到0.5×1012病毒顆粒/ml。

1.2.4 3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化 3T3-L1細胞按照常規的貼壁細胞方法培養。在細胞狀態良好時,傳代分瓶(1×105/ml）,細胞接觸抑制兩天后加入含10%胎牛血清的DMEM培養液(含0.5 mM 3-異丁基-1甲基黃呤、10 μ g/ml胰島素 、0.25 μ M 地塞米松）培養兩天,接著換成含10%胎牛血清的DMEM培養液(含10μ g/ml胰島素）培養兩天,最后改為含10%胎牛血清的DMEM培養,每兩天換液,直至90%的細胞為成熟的脂肪細胞。

1.2.5 Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體轉染成熟的3T3-L1,Real-time RT-PCR檢測脂肪細胞中SIK2 mRNA的表達 脂肪細胞分別用 2.5×1010、1×1011、2.5×1011純化病毒顆粒/ml Ad-shRNA-SIK2腺病毒和空載體病毒轉染成熟3T3-L1脂肪細胞,并以空載體病毒作為陰性對照,更換培養液后在37℃細胞培養箱中繼續培養48小時后,收集細胞,提取細胞總RNA,Real-time RT-PCR檢測脂肪細胞中SIK2 mRNA的表達。挑選最佳感染病毒濃度。

1.2.6 Western blot分析沉默效果 pAd-shRNA-SIK2重組病毒和對照空載體腺病毒分別感染3T3-L1分化脂肪細胞48 h后,收集細胞用PBS洗滌3次,提取總蛋白,按《分子克隆實驗操作指南》取等量蛋白20 g經十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE）電泳分離蛋白,然后電轉移至PVDF膜上,一抗分別為SIK2兔抗鼠多克隆抗體和兔抗鼠β-actin多克隆抗體,二抗為HRP標記的山羊抗兔lgG。用化學發光法顯色蛋白表達水平。

1.2.7 統計分析 用SPSS 11.0軟件進行統計分析。所有計量資料采用均數±標準差(ˉx±s）來表示,組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為顯著統計學差異。

2 結果

2.1 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質粒的測序結果送3個穿梭質粒測序后,證實所設計ds oligo已經正確插入pENTR/U6載體中,位于人u6啟動子和PolⅢ終止子之間。

2.2 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質粒轉導3T3-L1細胞后,RT-PCR篩選最佳穿梭質粒:將構建好的3個質粒轉導入脂肪細胞后,第5天用Real-time PCR檢測3T3-L1脂肪細胞SIK2 mRNA的基因表達,結果以目標基因與GAPDH基因表達的比值表示,結果顯示SIK2 shRNA-1,2,3均對SIK2有明顯的抑制作用(P＜0.05）,其中SIK2 shRNA-2對 3T3-L1細胞SIK2表達抑制作用最強,抑制率為86%(圖1）。

2.3 不同濃度的Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體轉染成熟的3T3-L1細胞后,RT-PCR篩選最佳轉染濃度:以空載體為對照,Real-time PCR測量三種濃度的2.5×1010、1×1011、2.5×1011純化腺病毒顆粒/ml轉染脂肪細胞后的SIK2mRNA的基因沉默效率。結果顯示三種濃度純化腺病毒顆粒均對成熟的3T3-L1細胞SIK2 mRNA表達有明顯的抑制作用(P＜0.05）,其中2.5×1011純化腺病毒顆粒/ml的濃度沉默效率最高,達到71%(圖2）。

圖1 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質粒干擾SIK2 mRNA基因表達效果

圖2 Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體干擾SIK2 mRNA基因表達效果

2.4 Western blot檢測3T3-L1脂肪細胞Ad-shRNASIK2腺病毒載體的RNA干擾SIK2蛋白表達效果:用2.5×1011病毒顆粒/ml Ad-SIK2腺病毒轉染成熟3T3-L1脂肪細胞48 h后,收集細胞經蛋白質印跡分析,可見感染空載體腺病毒的細胞分子量約為120 kD的條帶,而感染pAd-SIK2重組病毒的細胞條帶明顯降低,見圖3。

圖3 Ad-shRNA-SIK2腺病毒干擾SIK2的蛋白表達

3 討論

肥胖已成為嚴重危害人類健康的社會問題?，F有大約十億的成年人是超重,其中3億成年人是肥胖。肥胖和超體重是高血壓、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、腦卒中等多種疾病的重要危險因素[3]。控制肥胖,減少機體脂肪聚集可降低心腦血管等疾病的危險性和發病率。能量代謝失衡是導致肥胖的根本原因。作為細胞能量監測器,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK,5'AMP activated protein kinase）系統一直密切監視著細胞的能量狀態。AMPK的活性受AMP/ATP比值的調節。應激反應可通過ATP的產生減少或利用增加,使細胞內AMP/ATP的比值增加,從而激活AMPK。激活的AMPK可激發一系列的反應來恢復細胞內的能量平衡。AMPK可啟動分解代謝途徑,如脂肪酸氧化和糖酵解,從而增加ATP的產生,同時關閉合成代謝途徑,如脂肪酸合成和蛋白合成,減少ATP的消耗[4]。目前AMPK在肌肉和肝臟的能量代謝中的作用有廣泛的研究,有關AMPK在脂肪組織中的研究較少,作用并不明確。

SIK2是AMPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶,相對特異性地在脂肪組織表達[5]。有文獻報道肥胖或糖尿病老鼠脂肪組織中SIK2的活性升高[6],饑餓時脂肪組織的SIK2表達顯著升高[1],SIK2可能是脂肪組織能量的代謝重要調節因子,起著AMPK樣的能量感受器作用。明確SIK2在體內脂肪組織內的作用和分子機制,有助于對肥胖和II型糖尿病脂代謝紊亂的理解和認識。本實驗采用RNAi技術,以SIK2為靶基因,設計三對編碼SIK2shRNA的寡核苷酸鏈,定向克隆至 shRNA質粒表達載體pENTR/U6-shRNA穿梭質粒,在3T3-L1細胞中表達篩選RNA干擾效率最高的一對SIK2 shRNA-2。通過同源重組,在體外構建表達SIK2 shRNA的腺病毒表達載體。純化的載體轉染到成熟的3T3-L1脂肪細胞系后,在U6啟動子作用下在細胞內轉錄出單鏈RNA,轉錄體自身折疊形成特異的短發夾結構shRNA,在細胞內產生發夾狀的siRNA,進而特異性導致SIK2 mRNA降解,長期而有效地沉默了小鼠成熟脂肪細胞3T3-L1的SIK2蛋白的表達。本實驗通過腺病毒介導的基因轉移技術,成功轉染3T3-L1成熟脂肪細胞系,特異性地干擾SIK2 mRNA表達(71%）,進而導致SIK2蛋白的合成明顯減少。SIK2 shRNA腺病毒表達載體的成功構建為進一步觀察SIK2基因在脂肪細胞中的作用和分子機制,研究SIK2與肥胖的關系提供了實驗基礎。隨著對SIK2的深入研究,必將促進肥胖病脂代謝紊亂的研究發展,為研究肥胖的基因治療提供新思路。

[1]Du J,Chen Q,Takemori H,Xu H.SIK2 inhibits expression of lipogenic genes in adipocytes[J].Obesity,2008,16(3）:531.

[2]Reynolds A,Leake D,Boese Q,et al.Rational siRNA design for RNA interference[J].Nat Biotechnol,2004,22(3）:326.

[3]黃 輝,陳 潔,王景峰,等.EETs下調在高脂誘導肥胖相關高血壓中的作用[J].中國病理生理雜志,2008,24(11）:2113.

[4]Kahn BB,Alquier T,Carling D,and Hardie DG.AMP-activated protein kinase:ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism[J].Cell Metab,2005,1(1）:15.

[5]Katoh Y,Takemori H,Horike N,et al.Salt-inducible kinase(SIK）isoforms:their involvement in steroidogenesis and adipogenesis[J].Mol Cell Endocrinol,2004,217(1-2）:109.

[6]Horike N,Takemori H,Katoh Y,et al.Adipose-specific expression,phosphorylation of Ser794in insulin receptor substrate-1,and activation in diabetic animals of salt-inducible kinase-2[J].J Biol Chem,2003,278(20）:18440.