豚鼠膀胱不同區(qū)域逼尿肌的興奮性觀察

韓 濤，王勤章*，司軍強，徐禮臻，丁國富，趙 磊，王江平

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000;2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

膀胱逼尿肌具有在一定外加張力作用下自發(fā)興奮收縮的特性，且不能被神經(jīng)阻滯劑所抑制，這種收縮不依賴神經(jīng)因素而與膀胱平滑肌本身特性有關(guān)，是一種由起搏細胞控制的肌源性的自發(fā)興奮、收縮［1，2］，即逼尿肌組織是具有自主產(chǎn)生興奮能力的組織，應(yīng)該含有能夠產(chǎn)生自發(fā)性興奮的細胞成分。2010年12月25日～2011年7月1日，我們通過體外肌條收縮實驗和肌電位記錄觀察豚鼠膀胱不同區(qū)域逼尿肌的收縮活動頻率、幅度以及肌電位頻率、幅度的變化，觀察其興奮性的大小，確定興奮電位傳導(dǎo)順序。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及主要試劑、器械 3月齡普通級醫(yī)學(xué)實驗動物三色毛豚鼠20只，體質(zhì)量350～550 g，雌雄不限，于室內(nèi)分籠喂養(yǎng)，環(huán)境溫度21～22℃、相對濕度50%±5%，每日給予足量清潔飲水。Kreb溶液的配制:每次實驗前用電子天平精確稱取NaCl 6．96 g、KCl 0．35 g、MgSO40．296 g、KH2PO40．164 g、NaHCO31．294 g、Glu 2．07 g、CaCl20．278 g，溶于1 000 ml蒸餾水，攪拌使其完全溶解，最后用pH測試儀標(biāo)定pH至7．35～7．45。BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，F(xiàn)T100肌肉張力換能器，恒溫平滑肌槽等。

1．2 膀胱不同區(qū)域逼尿肌離體肌條的制作 頸部脫臼法處死豚鼠，無菌條件下迅速切取膀胱，用Kreb溶液沖洗。在自然松弛狀態(tài)下按解剖部位分為膀胱頂、膀胱體、膀胱頸，用自制雙刃平行刀片在上述各部位分別切取相同大小(3 mm×4 mm)的逼尿肌肌條，分別置于盛有新鮮配制Kreb溶液的標(biāo)記性硅膠培養(yǎng)皿中。逼尿肌肌條平展、內(nèi)膜面向上，在解剖顯微鏡下，用眼科剪、鑷剔除黏膜層及黏膜下層;持續(xù)給予95%O2和5%CO2混合氣體(調(diào)節(jié)氣泡大小，使其細小均勻、持續(xù)、穩(wěn)定、緩慢自平滑肌槽底部的固定器冒出，既能保持管內(nèi)穩(wěn)定的pH值，又不會影響到記錄前曲線)。不同區(qū)域的離體肌條在距離兩末端1 mm處用4-0絲線扎緊打結(jié)，置4℃的Kreb溶液中保存。

1．3 離體逼尿肌肌條收縮特性檢測 開啟BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)。將肌條一端固定在肌槽底部的掛鉤上，另一端通過 FT100肌肉張力換能器與BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)相連。肌條全部浸入37℃的Kreb液中，并盡量處于垂直狀態(tài)。調(diào)節(jié)固定肌肉張力換能器的一維位移微調(diào)器，使離體逼尿肌肌條處于無張力狀態(tài)，溫浴30 min。調(diào)節(jié)微螺旋，根據(jù)顯示器所示給予張力換能器1 g負荷，溫育20 min時更換37℃恒溫Kreb液1次。通道模式:張力模式，時間常數(shù)為DC，濾波為10 Hz，掃描速度為25 s/Div。觀察記錄不同區(qū)域離體逼尿肌肌條的收縮頻率(次/min)和幅度(g)，每個肌條檢測20 min，取其中5 min檢測結(jié)果的平均值。

1．4 離體逼尿肌肌條電位檢測 開啟BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)。將肌條一端固定在肌槽底部的掛鉤上，另一端通過FT100肌肉張力換能器與BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)相連。將平衡后的肌條一端用絲線固定于平滑肌槽的底部，另一端懸掛于張力換能器，上1/4段間斷露出液面，作為肌電位測量區(qū)域。肌電位調(diào)零。調(diào)節(jié)微量位移器，使肌條張力維持于0 g(即靜息位)。將自制的懸浮式雙極銀針電極前端置于肌條表面，電極前端相距3 mm，電極導(dǎo)線與BL-420F型生物機能實驗系統(tǒng)相連，選擇通道模式為肌電模式，時間常數(shù)為0．3 s，濾波為50 Hz，掃描速度為25 s/Div。檢測信號經(jīng)Ch2通道輸入計算機，經(jīng)專門用于肌電信號采集處理的軟件系統(tǒng)處理后得到直觀的肌電波形圖像并儲存。觀察記錄不同區(qū)域離體逼尿肌肌條的肌電頻率(Hz)和幅度(μV)。不同區(qū)域的離體逼尿肌肌條分別檢測20 min，取其中5 min檢測結(jié)果的平均值。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析和q檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

同等張力條件下，膀胱頂、膀胱體、膀胱頸部逼尿肌肌條收縮頻率分別為(8．3±1．34)、(6．2±0．79)、(3．0 ±0．82)次/min，收縮幅度分別為(0．83±0．13)、(0．63 ±0．09)、(0．52 ±0．03)g，膀胱不同區(qū)域離體逼尿肌肌條收縮頻率和收縮幅度相比，P均 ＜0．05。

膀胱頂、膀胱體、膀胱頸部逼尿肌肌條肌電幅度分別為(316．09 ± 60．34)、(235．02 ± 26．95)、(148．05±38．17)μV，肌電頻率分別為(0．50 ±0．09)、(0．49 ±0．12)、(0．47 ±0．12)Hz，膀胱不同區(qū)域離體逼尿肌肌條肌電幅度相比，P均＜0．05。

3 討論

1996年，Smet等［3］首先描述了在豚鼠和人逼尿肌上與胃腸道起搏細胞Cajal間質(zhì)細胞(ICCs)類似的膀胱間質(zhì)細胞。由于該細胞在免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)上與ICCs相似，故稱之膀胱ICCs樣細胞(ICCs-like)。Hashitani等［4，5］對豚鼠離體逼尿肌肌條的研究發(fā)現(xiàn)，逼尿肌的自發(fā)性電活動源于逼尿肌束邊緣的細胞，細胞內(nèi)的鈣濃度首先自發(fā)的一過性增高，隨后刺激周圍細胞產(chǎn)生動作電位(AP)，并通過細胞間的縫隙連接傳導(dǎo)，引起其他肌束的電位變化和收縮活動，而免疫組織學(xué)檢測顯示膀胱ICCs-like恰好位于逼尿肌肌束的邊緣，形成了通過縫隙連接而相互連接的細胞層。表明ICCs-like很可能就是逼尿肌自發(fā)性電活動的起源。Biers等［6］在研究中發(fā)現(xiàn)，甲磺酸伊馬替尼(IM)作為C-kit受體抑制劑，可明顯抑制逼尿肌不穩(wěn)定(DI)患者離體膀胱平滑肌肌條的自發(fā)性收縮的興奮性，并提高在體豚鼠膀胱的順應(yīng)性和膀胱容量。這些無疑也表明ICCs-like與膀胱平滑肌興奮起搏的起源和調(diào)控有密切關(guān)系。

Shafik等［1］發(fā)現(xiàn)，人膀胱 ICCs-like呈梭形或紡錘形，并呈樹枝狀突起，相互連接成一個細胞網(wǎng)，平行分布于平滑肌細胞周圍，在膀胱頂部密集分布，推測ICCs-like是人膀胱活動的起搏細胞。我們前期利用免疫熒光對ICCs-like在豚鼠膀胱內(nèi)的分布情況進行了觀察，發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)不同部位ICCs-like的分布情況不同，在膀胱頂部最多，體部次之，頸部最少。推測膀胱不同區(qū)域逼尿肌的興奮性與ICCs-like的分布密度關(guān)系密切。為了驗證上述推測，我們在對膀胱不同區(qū)域肌條組織興奮收縮實驗的基礎(chǔ)上進一步對其給予了細胞間通訊阻滯劑2-APB的抑制實驗，結(jié)果表現(xiàn)為膀胱頂部的抑制程度最為顯著。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱逼尿肌不同區(qū)域的興奮程度存在一定的差異，頂部興奮性最高，體部次之，頸部最弱。膀胱頂部可能為膀胱興奮的潛在起搏點。本研究結(jié)果為下一步深入研究ICCs-like充當(dāng)膀胱逼尿肌起搏細胞提供了理論依據(jù)。

［1］Shafik A，El-Sibai O，Shafik AA，et al．Identification of interstitial cells of Cajal in human urinary bladder:concept of vesical pacemaker［J］．Urology，2004，64(4):809-813．

［2］Pezzone MA，Watkins SC，Alber SM，et al．Identification of c-kitpositive cells in the mouse ureter:the interstitial cells of Cajal of the urinary tract［J］．Am J Physiol Renal Physiol，2003，284(5):925-929．

［3］Smet PJ，Jonavicius J，Marshall VR，et al．Distribution of nitric oxide synthase-immunoreactive nerves and identification of the cellular targets of nitric oxide in guinea-pig and human urinary bladder by cGMP immunohistochemistry［J］．Neuroscience，1996，71(2):337-348．

［4］Hashitani H，F(xiàn)ukuta H，Takano H，et al．Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder［J］．J Physiol，2001，530(Pt 2):273-286．

［5］Popescu LM，Gherghiceanu M，Hinescu ME，et al．Insights into the interstitium of ventricular myocardium:interstitial Cajal-like cells［J］．J Cell Mol Med，2006，10(2):429-458．

［6］Biers SM，Reynard JM，Doore T，et al．The functional effects of a C-kit tyrosine inhibitor on guinea-pig and human detrusor［J］．BJU Int，2006，97(3):612-616．