環介導等溫擴增技術的研究進展

馬艷平,劉振興,郝 樂,林 敏,孟 軒,柯 浩

(廣東省農業科學院獸醫研究所廣東省獸醫公共衛生公共實驗室,廣東廣州,510640)

核酸擴增是生命科學領域的常用研究工具,自 20世紀 80年代聚合酶鏈式反應(PCR)問世以來[1],再到以后出現的核酸等溫擴增技術、再生式序列復制和鏈置換擴增技術等以核酸檢測為基礎的分子生物學技術在醫學和生物學領域、醫學診斷和傳染性疾病的檢測得到了廣泛應用[2]。但由于核酸的檢測需要昂貴的儀器設備,存在特異性不高、操作程序復雜等特點,大大限制了作為快速診斷方法的應用。2000年Notomi等開發了一種新的核酸等溫擴增方法,即環介導等溫擴增法(1oop-mediated isothermal amp lification,LAMP)。其特點是在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地擴增靶序列[3],使其作為快速診斷成為可能。它是針對靶基因的 6個區域設計 4種特異引物,利用一種鏈置換 DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在等溫條件(約 65℃)保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴增反應。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。基因的擴增和產物的檢測可一步完成,擴增效率高,可在 15～60m in擴增 109～1010倍[4]。所有靶基因序列的檢測可只通過擴增產物的有無來判別。該技術已經廣泛應用于病毒、細菌、寄生蟲等方面的檢測。

1 環介導等溫擴增技術的原理

1.1 引物設計

針對靶基因 6個特異序列(3′端的 F3c,F2c,F1c區以及 5′端的 Bl,B2,B 3區)設計 4條引物,即上游內部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游內部引物(BIP)、下游外部引物(B3)[5]。后來添加了 2條環狀引物,上游環狀引物(LF)和下游環狀引物(LB)。……