狼毒水提液對人A549肺癌細胞凋亡的影響*

楊柯 張京玲 黃謙 王義善

（1濱州醫學院 山東煙臺264003；2山東省巨野縣人民醫院 巨野274900；3中國人民解放軍第107醫院腫瘤中心 煙臺264002）

中藥狼毒大戟為大戟科植物狼毒大戟的根，早在幾千年以前就有記載，具有散結、逐水、止痛、殺蟲的療效。長期臨床研究發現狼毒具有較好的抗腫瘤作用，且能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖。本實驗旨在探討狼毒大戟誘導體外培養的人A549細胞凋亡的作用，以期為臨床治療非小細胞肺癌提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥狼毒水提液由中國人民解放軍第107醫院腫瘤實驗中心配置，取得濟南軍區制劑許可（濟聯制字2000BM08046）；非小細胞肺癌A549細胞購自中科院上海細胞庫；1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司；Annexin-V FITC/PI雙染試劑盒、細胞周期檢測試劑盒均購自BD公司。

1.2 細胞培養 用含10%胎牛血清的1640培養基，于溫度為37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫培養箱中常規培養，隔日傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 分組 將對數生長期的細胞傳代分組，分別為空白組、狼毒組（0.8 mg/mL），每組三個復孔，細胞貼壁后給予藥物干預，繼續常溫培養24 h后收集細胞用于實驗。

1.4 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 離心收集狼毒組和空白組培養24 h的人A549細胞，2 000 rpm離心5 min，棄培養基。用冷PBS洗滌細胞兩次，每次2 000 rpm離心5 min。用400 μL Annexin V結合懸浮細胞，濃度大約為1×106cells/mL。在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin V FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入 10 μL PI染色液后輕輕混勻，于 2～8 ℃避光條件下孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5 熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞 滴1滴Annexin-V FITC/PI染色后的細胞于載玻片上，蓋玻片封片，倒置熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。

2 結果

2.1 狼毒對人A549細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果表明，狼毒大戟可以較明顯地促進人A549細胞的凋亡，空白組凋亡率為0.3%，狼毒組凋亡率為34.1%。

2.2 熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞 倒置熒光顯微鏡下觀察，狼毒組凋亡細胞明顯多于空白組。

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家非小細胞肺癌占肺癌發病率的70%，并呈逐年上升趨勢。肺癌的治療以放化療為主，但其毒副作用較大，嚴重影響腫瘤患者生活質量，且常加快腫瘤的轉移。隨著中國傳統醫學的發展，中西醫結合治療腫瘤已經廣泛用于臨床，醫學界也出現了以補充替代為醫療目的的研究[1]。中醫治療不僅能控制腫瘤發展還能提高機體免疫力，臨床研究發現[2～5]中藥狼毒在控制腫瘤發展、提高患者生活質量上顯示了重要作用。Wang L等[6]研究發現狼毒大戟能顯著抑制黑色素瘤的增殖并促進IL-2的表達。這些研究充分顯示了中藥狼毒在治療腫瘤方面的多靶點雙向調節作用。狼毒雖然前景廣闊，但是關于狼毒抗腫瘤作用機制及有效單體成分，亟待深入研究。

[1]Sankaranarayanan A,NarenderT,KumarS,etal.Alliumsativum constituents:effect on free radical generation from rat neutrophils[J].Cell Mol Biol(Noisylegrand),2007,53(5):63-67

[2]王義善,鄭秋生,賈喜風,等.狼毒抑制降低癌細胞惡性表型小鼠體內轉移及彗星電泳實驗研究[J].中醫雜志,2007,8(1):1-3

[3]王義善,鄭秋生,姜鵬,等.狼毒水提液抗腫瘤的實驗研究[J].中華醫學進展雜志,2006,4(6):1

[4]王義善.中藥灌注RF加溫IMCRT內外治法于臨床腫瘤應用研究[J].中華藥學與臨床,2007,3(3):1

[5]韓麗英,陳楓,張玉高,等.大蒜素對K562細胞增殖抑制和誘導凋亡作用的實驗研究[J].臨床血液學雜志,2006,19(4):2

[6]Wang L,Duan H,Wang Y,et al.Inhibitory effects of Lang-du extract on the in vitro and in vivo growth of melanoma cells and its molecular mechanisms of action [J].Cytotechnology,2010,62(4):357-366