皮膚組織冰凍切片在直接免疫熒光法中包埋劑的改良應用

鄭燕璇 王曉鴻 曹婉維 李孜孜 李巍

皮膚疾病中變態反應在其病因發病機制中占很大比重，因此在皮膚活檢標本診斷中顯示抗原或抗體是很重要的，一般使用冰凍切片直接免疫熒光法觀察切片標本上熒光抗體染色結果作為抗原的鑒定和定位。皮膚活檢標本冰凍切片行直接免疫熒光法要求切片質量優良，制作一張優質的冰凍切片，制片過程中的每一個環節都很重要，其中包括對包埋劑的選擇應用。包埋劑經冷凍后(-20℃ ～-25℃)對皮膚組織可起到支托固定的作用，現大部分醫院病理科在制作冰凍切片時常用的包埋劑是OCT，中山大學附屬第五醫院病理科在多年臨床工作中使用普通膠水替代OCT包埋組織(包括皮膚活檢標本、腎臟活檢標本、手術切除標本等)，所制冰凍切片用于直接免疫熒光檢查與使用OCT包埋劑所制冰凍切片用于直接免疫熒光檢查效果相同，現介紹如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料 皮膚活檢標本;普通膠水(用清潔干凈的OCT空瓶裝載);組織固著器;載玻片;熒光抗體(兔抗人IgA、兔抗人IgG、兔抗人IgM、兔抗人C3)抗體均為丹麥DAKO公司產品;PBS;緩沖甘油等。

1.2 方法 將皮膚活檢組織取材后放置在待用的組織固著器正中位置上，用普通膠水替代OCT將組織塊完全包埋。在-20℃～-25℃溫度中固著器上的組織被包埋劑包裹迅速凝凍固定，將固著器放置到冰凍切片機的冷凍頭上(冷凍頭設定溫度為-15℃左右)。開始修切冷凍頭上的組織至組織完全暴露時留片，切片要求盡量薄切，以利于抗原抗體接觸和鏡檢［1］。取出切片用吹風機冷風檔吹干固定，將pH7.4的PBS液平鋪于切片上浸泡2 min。甩干PBS將稀釋好的熒光抗體滴于切片上，在37℃溫箱內孵育8～10 min。甩去切片上的熒光抗體，用pH7.4的PBS液平鋪浸泡切片2 min。甩去PBS用紙巾擦去組織周邊的液體，滴加緩沖甘油封片［2］。

2 結果

用膠水包埋的皮膚活檢組織凝凍迅速，質感均勻，易切出完整、連續的組織片，易展片，留片后膠水在玻片上容易用水洗凈，同時組織不易脫落。制成免疫熒光片后用熒光顯微鏡檢查(最好即做即看，避免熒光消退，影響診斷結果)，免疫熒光著色不受影響，背景染色、陽性強度及陽性檢出率與用OCT包埋劑包埋的冰凍切片制成的免疫熒光片相比較效果無異。

3 討論

皮膚活檢標本的免疫熒光檢查對皮膚疾病病理診斷起重要的輔助作用，因此皮膚標本制片的好壞直接影響到檢測的結果。在皮膚標本制片過程中應力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和包埋過程中不發生溶解和變性，也不擴散至鄰近細胞或組織間隙中去。冰凍切片的原理是用物理方法低溫冰凍被包埋劑包埋的組織塊后再切片制片，包埋劑不會破壞抗原的完整性，不會引起抗原發生溶解和變性。用包埋劑將組織塊包埋，在低溫下迅速凝凍后能對組織塊起支托固定的作用，達到容易切片的目的。質量優良的包埋劑(如進口OCT)凝凍時間短，切片時質感滑脆均勻，易切片、展片，易用清水漂洗干凈。質量差的包埋劑包埋組織塊時凝凍時間長，切片時包埋劑發硬，不易切片及展片，不易用清水漂洗干凈，且容易使組織脫落。本科多年來通過反復實驗和臨床應用后，認為普通膠水代替OCT包埋來制作冰凍切片用于直接免疫熒光檢查效果完全與用OCT包埋劑(質量優良的包埋劑)所制切片無異。普通膠水價格便宜，容易購買，進口OCT價格昂貴，同規格型號的產品相比較，后者價格是前者的上百倍。用普通膠水代替質量優良的OCT包埋皮膚活檢組織來制作冰凍切片用于直接免疫熒光檢查，大大降低了成本，且同樣能在短時間內制出質地優良的冰凍切片，此方法值得推廣。

［1］王伯沄，李玉松，黃高昇，等.組織切片技術.病理學技術，2000，6(1):76-94.

［2］王伯沄，李玉松，黃高昇，等.腎活檢標本的制作技術.病理學技術，2000，6(1):949-952.